Восстановление хрящевой ткани с помощью клеточных или тканеинженерных продуктов является важной медицинской задачей вследствие распространенности воспалительнодегенеративных процессов с вовлечением поверхностных слоев костной и хрящевой ткани. Наиболее часто в мире встречается патология хрящевой ткани — гонартроз. Это полиэтиологическое дегенеративно-дистрофическое заболевание характеризуется поражением суставного хряща, субхондрального и метафизарного слоя кости, а также синовиальной оболочки, связок, капсулы и мышц и сопровождается формированием костно-хрящевых разрастаний, что проявляется болью и ограничением движений в суставе. В России ежегодно выявляют около 80 000 случаев гонартроза. Согласно данным эпидемиологических исследований, этой патологией страдают 8–20% взрослого населения в зависимости от региона [1].

Гонартроз прогрессирует годами, и на разных стадиях заболевания применяют различные подходы в лечении. В соответствии с отечественными клиническими рекомендациями, на ранних этапах заболевания рекомендуют неинвазивную терапию, сочетающую фармакологические и физиотерапевтические методы [2]. Стоит отметить, что фармакологическая составляющая терапии, включающая в себя применение противовоспалительных нестероидных (НПВП) и стероидных препаратов (кратким курсом), носит симптоматический характер и практически не влияет на регенерацию и функциональную активность гиалинового хряща. На более поздних этапах заболевания, при неэффективности неинвазивной терапии и значительных повреждениях хрящевой ткани, появляется необходимость в хирургическом вмешательстве, включающем в себя абразивную хондропластику, корригирующую остеотомию и эндропротезирование сустава [3].

Использование клеточных продуктов для восстановления поврежденной хрящевой ткани стало новым направлением регенеративной медицины. Источником клеток в подобных случаях могут служить мезенхимные стволовые клетки (МСК), аутологичные и аллогенные хондроциты.

Несмотря на то что клеточные продукты на основе аутологичных хондроцитов для восстановления хрящевой ткани уже присутствуют на медицинском и биотехнологическом рынках, они имеют ряд ограничений. Во-первых, пока они больше направлены на коррекцию незначительных повреждений суставных хрящей [4, 5]. Во-вторых, часто в силу ряда причин невозможно получить в достаточном количестве аутологичные хондроциты для создания полноценного хрящевого импланта [2]. В-третьих, при некоторых патологиях хрящевой ткани аутологичный клеточный материал дает хондроциты со сниженной функциональностью, что требует длительного культивирования клеток для наработки необходимого количества материала [6, 7]. В этой связи индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) — многообещающий и емкий источник для получения хондроцитарных производных, однако данные об их безопасности и способности формировать полноценную, функционально активную хрящевую ткань достаточно ограничены, а сведения об иммуногенности противоречивы [8, 9]. К тому же получение ИПСК и их последующая дифференцировка и создание трансплантата — это длительный и дорогостоящий процесс, который нуждается в оптимизации и стандартизации. В литературе есть данные об успешном приживлении в суставном хряще обезьян ИПСК, дифференцированных в хондрогенном направлении. Однако размеры дефекта хрящевой ткани были небольшими, поэтому необходимы дальнейшие исследования на других моделях. Что касается исследования иммуногенности, трансплантат при подсадке в хрящевые дефекты через четыре недели не вызывал иммунной реакции у макаков, в то время как в костно-хрящевых дефектах трансплантат, хотя и оставался интактным, был окружен большим скоплением CD3⁺-Т-лимфоцитов [10].

Перспективным подходом представляется создание и применение хрящевых трансплантатов на основе аллогенных дифференцированных в хондроциты ИПСК с пониженной иммуногенностью, универсальных для всех реципиентов. Ряд исследований показывает успешное создание гипоиммуногенных трансплантатов на основе ИПСК с нокаутом главного комплекса гистосовместимости [11, 12]. Показано, что аллогенный хрящевой трансплантат, полученный из нокаутированных по B2M ИПСК, in vivo способствует накоплению натуральных киллеров вокруг костно-хрящевого дефекта [13]. Тем не менее, для хондроцитарных производных человека такие данные еще предстоит получить.

Целью исследования было сравнить иммуногенность образцов тканеинженерных препаратов хрящевой ткани, полученных in vitro из различных клеточных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование линий ИПСК с нокаутом и без нокаута B2M

ИПСК (далее — iPS) культивировали, как описано ранее [14]. Линия iPS с нокаутом B2M (iPS_dB2M) была получена ранее [15].

Дифференцировка хондроцитарных производных из ИПСК

Размороженные iPS и iPS_dB2M (для получения хондроцитарных производных без нокаута (iCh) и с нокаутом B2M (iCh_dB2M) соответственно) были посеяны в шестилуночные планшеты, предварительно обработанные Matrigel (Corning; США), в среде mTeSR1 (STEMCELL Technologies; Канада). Культивировали в СО₂-инкубаторах при +37 °С и 5% СО₂ до достижения монослоя. Все дальнейшие инкубации тоже проводили в СО₂-инкубаторах при +37 °С и 5% СО₂. Переводили в среду ДМЕМ/Ф12 (Gibco; США) с добавлением 10% FBS (HiMedia; Индия),

1% GlutaMAX (Gibco; США), 1% пенициллина/стрептомицина («ПанЭко»; Россия), Chir 10 мкМ (Miltenyi Biotec; США), ретиноевой кислоты 10 нМ (Miltenyi Biotec; США). Культивировали в течение 2 дней. Далее среду заменяли на ДМЕМ/Ф12 с 10% FBS, 1% GlutaMax, 1% пенициллина/стрептомицина, TGFβ 10 нг/мл (Miltenyi Biotec; США), BMP2 10 нг/мл (Miltenyi Biotec; США), B27 (Miltenyi Biotec; США), аскорбиновой кислоты 10 мкМ (Sigma; США), инсулин-трансферрин-селенита 1% («ПанЭко»; Россия). Культивировали в течение двух недель. Далее клетки пересаживали на две лунки шестилучного планшета. После дифференцировки клетки культивировали в среде ДМЕМ/Ф12 с 10% FBS, 1% GlutaMax, 1% пенициллин/стрептомицин, TGFβ 10 нг/мл, BMP2 10 нг/мл.

Контроль качества полученных из ИПСК хондроцитарных производных. Иммуноцитохимический анализ

Фиксированные 4%-м параформальдегидом (PFA) монослойные культуры обрабатывали 0,1% раствором Triton-Х100: для окрашивания на ядерный маркер — в течение 20 мин, поверхностные и цитоплазматические — 10 мин. После пермеабилизации культуры обрабатывали блокирующим раствором на основе 0,01М PBS с 3% козьей сыворотки и 0,1% Tween в течение 30 мин.

Монослойные культуры окрашивали первичными антителами к ядерному маркеру хондрогенеза Sox 9 (Rabbit, 1 : 400; Invitrogen, США), к маркеру протеогликанового хрящевого внеклеточного матрикса агрекану (Mouse, 1 : 500; Invitrogen, США), маркеру фибриллярного внеклеточного матрикса гиалинового хряща коллагену II типа (Rabbit, 1 : 200; Abcam, Великобритания) и маркеру волокнистого хряща коллагену I типа (Rabbit, 1:800, Invitrogen, США). Окрашивали растворами первичных антител на основе блокирующего раствора в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем культуры 3 раза отмывали 0,01 М раствором PBS.

Для окрашивания вторичными антителами использовали Alexa Fluor 555 (Goat, Anti-Rabbit, 1 : 500) и Alexa Fluor 546 (Goat, Anti-Human, 1:500) (Invitrogen; США). Окрашивание проводили в течение 1 ч в темноте. Затем культуры 3 раза отмывали 0,01 М раствором PBS. Для окрашивания ядер использовали 100 нг/мл DAPI (Sigma Aldrich; США). Окрашивание проводили в течение 15 мин, затем культуры 3 раза отмывали 0,01 М раствором PBS.

Анализ окрашенных препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus IX53F с четырьмя фильтрами флуоресценции (Olympus; Япония), используя программное обеспечение для морфометрии Olumpus cellSens Standard (Olympus; Япония).

Полимеразная цепная реакция

Для ПЦР-анализа экспрессии лизировали 1 млн клеток в буфере RLT (QIAGEN; Германия). РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN; Германия) в соответствии с протоколом производителя. Измерение концентрации тотальной РНК в образце проводили с использованием многорежимного ридера Infinite 200 Pro (Tecan; Швейцария) и программного обеспечения I-control. Для синтеза первой цепи кДНК с матрицы РНК использовали MMLV RT kit («Евроген»; Россия). Синтез проводили в соответствии с протоколом производителя. Для проведения ПЦР в реальном времени на одну лунку 96-луночного планшета (SSIbio, Scientific Specialities; США) добавляли 5 мкл 5х qPCRmix-HS SYBR («Евроген»; Россия), 0,8 мкл 10 мкМ праймера (таблица), 18,2 мкл воды и 1 мкл кДНК матрицы. В контрольные лунки планшета вместо кДНК матрицы добавляли еще 1 мкл воды.

Реакцию проводили при использовании термоциклера для амплификации нуклеиновых кислот 1000 CFX Manager исполнения C10000 Touch (Bio-Rad; США) и программного обеспечения CFX Manager. Количество циклов — 39. Анализ результатов проводили в программе Microsoft Excel (Microsoft; США) по методу ΔΔCt.

Получение первичной культуры хондроцитов из донорского материала

Выделение хондроцитов (далее — Chondro) проводили из биопсийного операционного материала пациента. Хрящ отмывали в 15 мл ДМЕМ с 2% пенициллина/стрептомицина («ПанЭко»; Россия). Затем помещали хрящ в чистую чашку Петри и измельчали стерильными ножницами и скальпелем в присутствии 4 мл среды ДМЕМ с 2% пенициллина/ стрептомицина. Промывали в 15 мл пробирке 1 раз той же средой. Кусочки хряща инкубировали в течение 40 мин на качалке при +37 °С и 5% СО₂ в 10 мл среды ДМЕМ с 2% пенициллина/стрептомицина и коллагеназы IV (Gibco; США) и ферментного препарата коллагеназы («БиоПрепарат»; Россия) в концентрации 3000 ед./мл.

После инкубации кусочки хряща центрифугировали 5 мин при 200 g, производили отмывку 1 раз, добавляли 10 мл среды для культивирования: ДМЕМ/Ф12 с 20% FBS, 1% GlutaMax, 1% пенициллин/стрептомицин и переносили в культуральный флакон T-75, предварительно обработанном 0,1% раствором желатина. Кусочки хряща культивировали при +37 °С и 5% СО₂ до достижения монослоя хондроцитов. Среду меняли раз в три дня.

Получение первичной культуры фибробластов из донорского материала

Пациенту проводили биопсию кожи предплечья. Биопсию помещали в каплю среды (ДМЕМ («ПанЭко»; Россия) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина) на чашку Петри и разрезали на мелкие кусочки (размером около 1 мм) острым стерильным скальпелем. Полученные кусочки помещали в отдельные чашки Петри диаметром 35 мм в 3 мл культуральной среды и прижимали стерильным покровным стеклом (Menzel Glasser; Германия). Среду меняли два раза в неделю. Через три недели фибробласты (далее — Fibro) отделяли и пассировали с использованием 0,25% раствора ЭДТА (Gibco; США).

Анализ активации и дегрануляции PBMC после кокультивации с хондроцитарными производными

Для получения мононуклеарных клеток периферической крови (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 9 мл крови здорового донора разводили в 2 раза PBS, аккуратно наслаивали кровь на Ficoll-Paque™ PLUS плотностью 1,077 г/см³ (GE Healthcare; США) и центрифугировали 350 g в течение 30 мин. Интерфазу отбирали и дважды промывали PBS. Полученные PBMC считали с помощью автоматического счетчика Luna и разводили средой (X-VIVO™ 15 (Lonza; Швейцария) + 100 Ед/мл IL2 + 10% FBS, инактивированной нагреванием) в концентрации 1 млн клеток в миллилитре.

Для проведения анализа, каждая из линий-мишеней (iPS, iPS_dB2M, Fibro, Chondro, iCh и iCh_dB2M) была посеяна в три лунки 96-луночного планшета в своей среде для культивирования. По достижении монослоя, среду отбирали и в лунку добавляли 200 мкл суспензии PBMC. Планшет переносили в инкубатор при +37 °С и 5% СО₂.

Для анализа активации CD8⁺-Т-лимфоцитов через сутки и через пять дней ресуспендировали клетки и отбирали их для последующего цитометрического анализа.

Для анализа дегрануляции CD8⁺-Т-лимфоцитов через 1 ч инкубации добавляли в лунки Brefeldin A в концентрации 100 нг/мл и инкубировали клетки на +37 °С и 5% СО₂ еще 4 ч. Затем клетки отбирали для цитометрического анализа.

Проточная цитометрия

Для оценки активации CD8⁺-Т-лимфоцитов использовали антитела CD3-PERCP-Cy5.5 (Sony; Япония), CD8BrilliantViolet421 (BD Bioscience; США), CD69-FITC (Sony; Япония)

Для анализа дегрануляции CD8⁺-Т-лимфоцитов использовали антитела  CD8-BrilliantViolet421 (BD Bioscience; США), CD3-PE (Abcam; Великобритания), CD107a-APC (Sony; Япония). Цитометрический анализ производили с помощью проточного цитометра NovoCyte Flow Cytometer. Данные цитометрии обрабатывали с помощью программы FlowJo (Tree Star Inc.; США).

Статистический анализ

Для сравнения долей активированных и дегранулировавших CD8⁺-Т-лимфоцитов использовали непарный t-критерий Стьюдента и ANOVA. Стастистически значимыми считали различия с p-значением меньше 0,05. Расчет выполняли на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp; USA) и программы SPSS Statistics 17.0 (IBM; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Контроль качества полученных из ИПСК хондроцитарных производных

Хондроцитарные производные, полученные путем направленной дифференцировки из ИПСК с нокаутом B2M и без него, исследовали на экспрессию основных хондрогенных маркеров. При анализе иммуноцитохимического маркирования наблюдали флуоресценцию белков хондроцитарного матрикса коллагенов I и II типа (COL1, COL2), аггрекана (ACAN), а также ядерного белка SOX9 в обеих линиях (рис. 1). При этом ИПСК на данные маркеры не окрашивали.

ПЦР в реальном времени также демонстрировал экспрессию этих хондрогенных маркеров как в производных с нокаутом B2M, так и без, при этом экспрессия коллагена I типа в клетках линии iСh_dB2M была ниже, чем в контрольной группе нативных хондроцитов человека, а экспрессия коллагена II типа, напротив, была выше (рис. 2). Кроме того, в производных ИПСК с нокаутом B2M наблюдали более низкую экспрессию ACAN и SOX9 по сравнению с хондроцитами человека, а также более низкую интенсивность флуоресценции в сравнении с линией без нокаута. В клетках линии iСh не выявили значительных отличий от контрольной группы в экспрессии рассматриваемых хондрогенных маркеров.

Анализ иммуногенности хондроцитарных производных

МНС I, главный комплекс гистосовместимости I класса, экспрессируется практически на всех клетках организма. Основной функцией этого белка является презентация эндогенных пептидов Т-лимфоцитам. Гены, кодирующие MHC I, высокополиморфны и различаются от человека к человеку, равно как и набор пептидов, способных презентироваться в соответствующей молекуле MHC I.

CD8⁺-T-лимфоциты при созревании приобретают толерантность к собственным эндогенным пептидам и МНС I, однако при попадании чужеродных клеток высока вероятность неспецифичного распознавания Т-клеточным рецептором комплекса «пептид — МНС I». Поэтому основное внимание уделили ответу CD8⁺- Т-лимфоцитов.

Чтобы оценить иммуногенность iCh-dB2M, кокультивировали эту линию с PBMC здорового донора. После пятидневной кокультивации определяли процент активированных CD69⁺- CD8⁺-Т-лимфоцитов. CD69, мембранный рецептор C-лектина второго типа, широко используют в качестве маркера ранней активации лимфоцитов. Экспрессия CD69 быстро индуцируется на поверхности Т-лимфоцитов после связывания Т-клеточного рецептора и CD3, что приводит к секреции цитокинов и пролиферации активированных клеток. Ряд статей указывает на то, что максимума экспрессия CD69 на Т-клетках достигает через 24 ч после стимуляции, а затем начинает снижаться [16, 17]. Поэтому мы провели повторный эксперимент, где измерили активацию Т-клеток через сутки после начала кокультивации.

Результаты цитометрического анализа представлены на рис. 3. В качестве положительного контроля использовали фибробласты здорового донора, а в качестве отрицательного — ИПСК, так как они обладают сниженной иммуногенностью [18]. Независимо от длительности кокультивации, процент активированных CD8⁺-Т-лимфоцитов при кокультивации с iCh-dB2M значимо не отличался от такового при кокультивации с iCh и хондроцитами и был выше, чем при кокультивации с iPS или без кокультивации. С одной стороны, это может означать, что нокаута B2M недостаточно, чтобы полученные в результате клетки стали гипоиммуногенными [11, 19]. С другой стороны, все использованные линии при пятидневной кокультивации приводили к активации значимо меньшего процента CD8⁺-Т-лимфоцитов (p < 0,01, непарный t-тест; данные не показаны) по сравнению с фибробластами, что, возможно, свидетельствует о сниженной иммуногенности хондроцитоподобных клеток и хондроцитов как таковых. По литературным данным, хондроциты способны создавать вокруг себя противовоспалительное микроокружение, что, вероятно, повлияло на результаты эксперимента [20, 21]. В то же время кокультивация в течение одного дня с фибробластами здорового донора не привела к активации CD8⁺-Т-лимфоцитов. Вероятно, такому результату способствовало несколько факторов. Вопервых, по результатам цитометрии, экспрессия MHC I на фибробластах этого донора была снижена по сравнению с другими линиями фибробластов, представленными в нашей лаборатории (данные не показаны). Во-вторых, на результат эксперимента могло повлиять частичное совпадение аллеля MHC I между PBMC и фибробластами. В результате, в случае пятидневной стимуляции имел место накопительный эффект, приводящий к активации значимо большего числа CD8⁺-Т-лимфоцитов, в то время как суточной стимуляции для данной линии оказалось недостаточно.

Таким образом, хондроцитарные производные iPS способны активировать CD8⁺-Т-лимфоциты из PBMC. Нокаут B2M не оказывает при этом существенного влияния на иммуногенность хондроцитарных производных iPS.

Для оценки иммуногенности хондроцитарных производных измеряли также цитотоксический ответ CD8⁺-Т-лимфоцитов при кокультивации линий с PBMC.

CD107a, он же LAMP-1, является лизосомноассоциированным мембранным гликопротеином. При дегрануляции CD8⁺-Т-лимфоцита, лизосомная гранула, содержащая в себе эффекторные литические молекулы, сливается с внешней мембраной CD8⁺-Т-лимфоцита. В результате этого содержимое гранулы доставляется в клетку-мишень, а CD107a оказывается на поверхности клетки и становится доступен для окрашивания антителами, как маркер цитотоксичности.

После пятичасовой кокультивации с линиями-мишенями в присутствии Брефельдина А снимали PBMC и окрашивали их антителами к CD3, CD8 и CD107a, после чего проводили цитометрический анализ.

Полученные данные в целом аналогичны предыдущим двум результатам (рис. 4). Экспрессия CD107a, и, как следствие, цитотоксическая активность CD8⁺-Тлимфоцитов, в присутствии хондроцитарных производных с нокаутом B2M, хондроцитов и фибробластов была значимо выше (p < 0,05; непарный тест Стьюдента), чем в присутствии iPS и без линии-мишени. Это свидетельствует об иммуногенности выбранных нами линий. Интересно, что iPS с нокаутом B2M также вызывали цитотоксический ответ. Подобных экспериментальных данных в литературе нами обнаружено не было. Учитывая, что схожая тенденция увеличения иммуногенности у iPS_dB2M по сравнению с iPS наблюдалась на протяжении всех трех экспериментов, можно допустить, что для данной линии полученный результат не является артефактом. В таком случае, вероятно, нокаут B2M каким-то образом повлиял на транскриптом линии [22]. В дальнейшем мы планируем проверить траскриптом линии iPS-dB2M и сравнить его с исходной линией.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Использование клеточных продуктов для восстановления повреждений хрящевой ткани в настоящее время является одним из самых перспективных и действенных видов терапии [23–25]. Тем не менее, ограниченные количества хрящевого клеточного материала являются серьезным препятствием для повсеместного использования данного вида лечения. За последние годы стало возможным получать клетки хрящевой ткани путем дифференцировки из ИПСК, что значительно упростило получение необходимого количества аутологичного клеточного источника для создания трансплантата. Однако данная процедура дорогостоящая, занимает несколько месяцев и требует валидации. Создание универсального гипоиммуногенного трасплантата помогло бы решить проблему недостатка клеточного материала для создания in vitro хрящевой ткани. Тем не менее, биобезопасность такого продукта не изучена.

Мы получили хондроцитарные производные из iPSC с нокаутом B2M и без него и провели анализ экспрессии хондрогенных маркеров. Экспрессия таких маркеров, как SOX9, аггрекан и коллагены I и II типов свидетельствует о приобретении производными ИПСК хондроцитарного фенотипа, что демонстрировали обе линии производных в нашем эксперименте. Стоит отметить, что по результатам ПЦР в реальном времени в iCh_dB2M Сol1 экспрессировался на более низком уровне, а Col2 — на более высоком, по сравнению с хондроцитами человека. Это подтверждает преобладание фенотипа гиалинового хряща в дифференцированных производных с нокаутом B2M, что более предпочтительно в перспективе клинического применения [26]. В то же время это может свидетельствовать и о появлении фибротических черт нативных хондроцитов человека вследствие культивирования [27]. Хотя экспрессия Sox9 у iCh_B2M была ниже, чем у iCh, нет оснований полагать, что это значимо отразилось на функциональности хондроцитарных производных [28, 29].

Полное удаление с поверхности клеток MHC I должно было привести к снижению иммуногенности хондроцитарных производных за счет избегания распознавания комплекса «MHC I–аутопептид» CD8⁺-Тлимфоцитами. Однако, по полученным нами результатам, нокаут B2M является недостаточной мерой для снижения иммуногенности хондроцитарных производных. Во всех трех проведенных нами экспериментах иммунный ответ CD8⁺-Т-клеток на хондроцитарные производные с деплецией B2M был значимо выше, чем на ИПСК. Существует несколько механизмов, благодаря которым могла произойти активация CD8⁺-Т-лимфоцитов.

Согласно одному из них, CD8⁺-Т-лимфоциты активировались не за счет непосредственного взаимодействия с хондроцитарными производными, а благодаря антигенпрезентирующим клеткам (АПК), присутствующим в PBMC. Как известно, антигенпрезентирующие клетки способны представлять пептиды поглощенных частиц в контексте MHC I и MHC II. Для активации CD8⁺-Т-лимфоцитов (и, как следствие, экспрессии CD69) достаточно распознать чужеродный пептид на АПК, а также, в некоторых случаях, получить костимуляцию от CD4⁺-Т-лимфоцитов [30, 31]. Что касается дегрануляции, показана способность CD8⁺-Т-лимфоцитов убивать опухолевые клетки, потерявшие MHC I. Этот эффект достигался в присутствии АПК, независимо от NK-клеток. Распознавание происходит за счет связывания рецептора NKG2D Т-клеток с лигандами (NKG2DL) на клетках-мишенях, а убийство — за счет секреции гранзимов [32]. В то же время Богомякова с соавторами показали, что фибробластные производные iPS экспрессируют на своей поверхности в 1,5 раза больше лигандов NKG2D по сравнению с фибробластами здорового человека [14]. Таким образом, можно предположить, что хондроцитарные производные из нашего эксперимента повысили экспрессию NKG2D лигандов, что сделало их потенциальной мишенью как для CD8⁺-Т-лимфоцитов, так и для NK-клеток. Хотя хондроциты (и, по-видимому, хондроцитарные производные iPS) создают вокруг себя противовоспалительное окружение [20, 21], это, судя по всему, не является абсолютной гарантией отсутствия иммунного ответа. Важно помнить, что хондроциты, попавшие в провоспалительный контекст (который неизбежен при трансплантации тканеинженерного препарата хряща), способны экспрессировать MHC II [21]. Хотя для хондроцитарных производных iPS этого не было показано in vitro [27], тестов in vivo на настоящий момент не проводилось. Поэтому, чтобы избежать иммунного ответа CD4⁺-Т-лимфоцитов, необходимо нокаутировать MHC II в хондроцитарных производных. В дополнение, ряд исследований демонстрирует успешное получение гипоиммуногенных производных iPS за счет нокаута MHC I, MHC II и гиперэкспрессии CD47 для регулирования NK-клеточного ответа [11, 12]. Эти данные, в совокупности, оставляют возможность для доработки универсального трансплантата хрящевой ткани на основе дифференцированных производных ИПСК.

ВЫВОДЫ

Полученные хондроцитарные производные ИПСК обладают такой же невысокой иммуногенностью, как и хондроциты человека, однако они вызывают больший иммунный ответ, чем гипоиммуногенные ИПСК. С одной стороны, это говорит о том, что полученные хондроциты потенциально могут служить источником продукта для терапии хрящевой ткани суставов, но с другой стороны, данное исследование показывает потенциальные риски, связанные с нестабильностью клеток после редактирования и избеганием иммунного ответа в случае туморогенеза. Таким образом, нокаут B2M не является достаточным условием гипоиммуногенности получаемых прототипов из таких клеток ткани, а хондроцитарные производные ИПСК нуждаются в дополнительных модификациях.