Комбинированный порок, известный как микротия или деформация ушной раковины с атрезией наружного слухового прохода (АНСП), который включает в себя аномалии развития наружного и среднего уха, встречается с частотой один случай на 10 000–15 000 новорожденных. Пациенты с данной патологией страдают не только от выраженной кондуктивной тугоухости, но и от грубого косметического дефекта [1–5].

Лечение микротии — сложная задача, предложено множество вариантов ее решения от использования ушного протеза до реконструктивно-восстановительной операции с использованием различных хирургических техник и реконструктивных материалов. Реконструктивновосстановительные операции в области головы и шеи должны решать одновременно ряд сложных задач не только по восстановлению утраченных органов, их частей или тканей, восстановлению функции, но и эстетической реабилитации [6–8].

В хирургической практике существуют три основных метода устранения микротии: применение аутореберного хряща, пористого полиэтиленового импланта и внутрикостных имплантатов для протезирования съемным протезом. Выбор метода лечения определяют в зависимости от степени выраженности микротии, функциональных целей после хирургической коррекции, возраста пациента и желания пациента или его представителей. Реконструкцию ушной раковины с помощью аутореберного трансплантата классически выполняют поэтапно, как описано Tanzer, Brent, Nagata, и Firmin. Аллопластические имплантаты получили большее признание в качестве еще одного варианта реконструкции уха, поскольку аллопластическая реконструкция может быть выполнена в более раннем возрасте без ущерба для донорской зоны. Реконструкцию уха на основе пористого полиэтилена (Su-Por, Omnipore, Medpor, Porex Surgical) в настоящее время рассматривают как стандартный метод коррекции микротии для детей от трех лет [3, 4, 9].

В ФГБУ НМИЦО ФМБА России с 2014 г. накоплен богатый опыт устранения микротии, более 516 случаев с использованием различных методик и материалов. Наилучший результат получен при использовании в качестве эндопротеза ушной раковины из гетероматериала на основе пористого полиэтилена. Достичь удовлетворительных хирургических результатов удалось в 80,48% случаев, в 19,52% развились осложнения, из них в 12,19% отмечена частичная экструзия завитка протеза, а в 7,31% потребовалась резекция части эндопротеза для закрытия дефекта ввиду его миграции и прорезывания через покровные мягкие ткани.

Проводили оценку эстетического результата реконструкции ушной раковины с использованием гетороматериала на основе пористого полиэтилена. В 24,39% случаев не получено выраженной заушной складки и достаточно оттопыренной ушной раковины в отдаленном послеоперационном периоде в связи с рубцеванием кожных трансплантатов и соответственно прижатием к черепу сформированной ушной раковины, что было расценено как неудовлетворительный результат. Во всех остальных 75,61% случаев сформированная ушная раковина имела четкие контуры завитка и противозавитка, правильное положение мочки и располагалась симметрично относительно контрлатерального уха. Таким образом можно сказать, что при использовании в качестве эндопротеза ушной раковины гетероматериала на основе пористого полиэтилена частота хирургических осложнений возникает в 19,52% случаях, а удовлетворительного эстетического результата возможно достичь лишь в 75,61% случаев. Полученные данные указывают на необходимость поиска новых методов и материалов для устранения микротии [10, 11].

Реконструктивно-восстановительная хирургия стремительно развивается на протяжении многих лет и последние годы — это направление носит междисциплинарный характер, особенно в области регенеративной медицины. Важным инструментом регенеративной медицины является тканевая инженерия, которая предполагает разработку конструкций из специальных материалов (матриксов, скаффолдов) и культивирование на них стволовых или тканеспецифичных клеток [12–19].

Достижения современной регенеративной медицины нашли свое применение в сердечно-сосудистой хирургии, травматологии, ортопедии, хирургии трахеи, абдоминальной хирургии, урологии, в пластической и эстетической хирургии, оториноларингологии и челюстнолицевой хирургии [7, 18, 20–22].

Совершенно очевидно, что данные технологии могут быть использованы в лечении микротии, что и послужило катализатором для проведения экспериментальной работы по поиску и созданию новых ушных эндопротезов с применением современных возможностей отечественной регенеративной медицины и тканевой инженерии. Целью нашего исследования было изучить возможности применения комбинированных матриц и тканевых инженерных конструкций из биополимеров для реконструкции ушной раковины.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В эксперименте в качестве живой биологической модели использовали два близкородственных минипига породы Sus salvanius. Средний вес минипигов составлял 37,5 кг. Минипигов содержали на базе научного центра биомедицинских технологий Федерального медикобиологического агентства в свободных от стресса условиях с предоставлением свободного доступа к еде и питью. Эксперимент состоял из нескольких этапов (рис. 1).

Для изготовления импланта использовали модифицированный FDM-принтер с картезианской кинематикой. Технологический процесс создания имплантата состоял из пяти основных этапов: 1) создание трехмерной модели ушной раковины; 2) преобразование и корректировка топологии уха; 3) подготовка клеточного компонента; 4) подготовка коллагенового гидрогеля; 5) изготовление импланта.

Для получения аутологичных хондроцитов из эластического хряща двумя бригадами хирургов был осуществлен забор ушного хряща с левого уха у двух особей под тотальной внутривенной анестезией. Размеры хрящей составили 1,5 на 1,5 см. Хрящи помещали в разные пробирки с транспортной питательной (буферной) средой. Далее производили выделение клеток хряща из ушного хряща с последующим их культивированием и размножением, данный процесс занял месяц. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco; США), содержащей 2 мл L-глутамина («Панэко»; Россия) и однократный раствор антибиотика-антимикотика (Gibco; США) с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (Gibco; США) при 37 °C и 5% CO₂. Для снятия клеток с подложки использовали раствор Версена («Панэко»; Россия) и 0,25%-й раствор трипсина-ЭДТА (Gibco; США).

После культивации хондроцитов был изготовлен биоинженерный имплантат, напечатанный из двух полимеров и коллагена. Для создания трехмерной модели ушной раковины использовали КТ/МРТ данных изображений ушной раковины здорового пациента и программное обеспечение ImageJ (США) и 3D Slicer (США). Преобразование и корректировку топологии уха для формирования модели имплантата производили с помощью программного обеспечения Autodesk Fusion 360 (США) и/или КОМПАС-3D (Россия). Для подготовки модели к печати использовали программное обеспечение Prusa Slicer и/или Super Slicer (США).

Имплантат изготавливали методом комбинированной трехмерной биопечати, для этого принтер располагали в стерильных условиях. Предварительно экструдеры принтера разогревали до 200 °С, столик — до 50 °С. Для ребер жесткости использовали полилактид (Ingeo 4032D, Китай; Natureworks LLC, США), для пористого каркаса использовали термопластичный полиуретан Elastollan 1170 А 10FC000. Гироидные поры полимерного каркаса заполняли гелеобразным коллагеном Вискол («Имтек»; Россия). Послойно производили печать сначала полилактидом, затем полиуретаном, обеспечивая впечатывание двух полимеров друг в друга. После формирования каркаса отдельной форсункой в него впечатывали гидрогелевую композицию. Для приготовления коллагенового гидрогеля, разведение и нейтрализацию производили при температуре +4 °C: сначала герметично соединяли шприц с культуральной средой (DMEM, 10% фетальная бычья сыворотка, 100 мМ Трис-HCl) с шприцом, содержащим 4% раствора коллагена 1-го типа (Viscol; Россия), в соотношении 1 : 4. Затем раствор коллагена тщательно смешивали с культуральной средой для получения нейтрализованного гомогенного раствора коллагена.

Кроме того, были подготовлены две пары цилиндров (диаметр — 10,5 мм, длина — 18 мм). «Цилиндр 1» (коллаген + аутогенные хондроциты) заполнили специально приготовленным раствором коллагена с аутогенными клетками хрящевой (хондроциты) ткани свиньи

(концентрация клеток — около 30 млн в 1 мл). «Цилиндр 2» (коллаген) — не заполнен, представлен коллагеновой основой.

После изготовления биоинженерных ушных раковин и цилиндров 1 и 2 производили их имплантацию под височную фасцию. Операцию осуществляли параллельно две бригады хирургов на обеих особях. Под тотальной внутривенной анестезией было произведено выделение височных фасций справа, в сформированное мышечное ложе установлен и обернут височной фасцией имплант ушной раковины. Аналогично у обеих особей выделяли височную фасцию слева, и под нее имплантировали

«Цилиндр 1» (коллаген + аутогенные хондроциты); «Цилиндр 2» (коллаген) был имплантирован под мобилизованную лобную мышцу. Таким образом, у двух особей сформированы три отдельных мышечно-фасциальных компартмента, с имплантированными биоинженерными материалами, которые никак не сообщаются друг с другом (рис. 2).

Период наблюдения составил 3 месяца. Далее обе особи были гуманно выведены из эксперимента путем внутривенной эвтаназии. Фрагменты имплантатов и дисков были изъяты и зафиксированы в 10%-м нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере. Все имплантированные материалы отправлены на гистологическое исследование.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После изъятия имплантатов производили первичную макроскопическую оценку их состояния. У обеих особей наблюдалась полная интеграция трансплантатов с их мышечными и фасциальными футлярами без признаков инфицирования или некроза тканей (рис. 3).

При последующем гистологическом исследовании бионженерного уха обеих особей с помощью окрашивания гематоксилин-эозином наблюдается практически идентичная картина. В обеих препаратах просматривается умеренно плотный утолщенный участок мышечной ткани с обильной фибро-васкулярной соединительной тканью, с кровенаполненными сосудами различного диаметра. Воспалительный инфильтрат не выявлен. К мышечной ткани мультифокально плотно прилегает плотная эозинофильная, бесклеточная ткань (предположительно коллаген). Центральная часть имеет лабиринтообразное строение из мышечных, переплетенных волокон, среди которых просматриваются обширные поля эозинофильной волокнистой ткани. Необходимо отметить, что в обоих препаратах присутствует выраженная васкуляризация с усилением по периферии центральной части, что косвенно подтверждает интеграция трансплантатов с их мышечными и фасциальными футлярами. В центральной части просматриваются множественные плотные лимфоплазмоцитарные инфильтраты с преобладанием плазмоцитов. Нейтрофильного воспаления, в том числе реакции отторжения, не было выявлено. Схожая гистологическая картина наблюдается и при окрашивании по Маллори, где большая часть препаратов насыщенно синего цвет, что, согласно методике окраски, соответствует коллагеновым волокнам. В определенных участках коллаген плотно прилегает к мышечным волокнам (окрашивание в коричневый цвет). При иммуногистохимическом анализе на маркеры неоангиогенеза (VEGF и СD31) у обоих препаратов была выявлена слабая экспрессия (рис. 4)

При гистологическом исследовании образца «Цилиндр 1» добавлением гидрогеля на основе коллагена 1-го типа с включением аутологичных хондроцитов выявлено, что препараты преимущественно состоят из рыхлой волокнистой ткани с пустотами по типу лабиринта. Местами встречаются узкие поля фиброза и мелкие округлые поля бесклеточной эозинофильной массы. Волокнистая ткань умеренно васкуляризированная, множество крупных, щелевидных кровенаполненных сосудов. Были также выявлены мультифокальные воспалительные лимфоплазмоцитарные инфильтраты, с образованием лимфоидных фолликулов, состоящих преимущественно из мелких лимфоцитов. Примечательно, что среди мышц прослеживаются узкая прослойка зрелой хрящевой ткани. При окрашивании по Маллори не более 75% обоих препаратов окрасилось в насыщенно синий цвет. По интенсивности окрашивания можно определить, что наиболее выражено содержание коллагена по периферии. В центре просматривается голубой, красный и синий цвет, что свидетельствует о присутствии коллагеновых волокон между мышечными пучками, на периферии препарата, вне области имплантата. При иммуногистохимическом анализе на экспрессию маркеров VEGF и CD31 выявлена выраженная экспрессия в эндотелиях сосудов (рис. 5).

При гистологическом исследовании образца «Цилиндр 1» при окраске препаратов гематоксилин-эозином преобладают участки тканей, полностью состоящих из умеренно плотной, волокнистой ткани и имеющих пустоты по принципу лабиринта. В средней части этих тканей по периферии просматривается фиброзная ткань, скудная васкуляризация. Вокруг сосудов просматриваются плотные лимфоплазмоцитарные муфты. В центральной части сосредоточены множественные плотные смешанные инфильтраты с преобладанием плазмоцитов, с единичными лимфоцитами, в меньшей степени нейтрофилами и различным количеством сидерофагов. Большая часть обоих препаратов при окрашивании по Малории имеет синий цвет разной интенсивности в зависимости от поля зрения, что свидетельствует о высоком преобладании коллагеновых волокон. Маркеры неоангиогенеза (VEGF и СD31) при иммуногистохимическом анализе слабо выражены (рис. 6).

Сравнительная характеристика гистологических препаратов биоинженерного уха, «Цилиндра 1» и «Цилиндра 2», полученных у обеих особей, представлена в таблица.

Анализ представленных в таблица данных позволяет предположить, что изготовленная конструкция способствовала образованию соединительнотканного регенерата, который имеет собственную сосудистую сеть, а строение волоконного остова регенерата подстроено под форму конструкции, что обеспечивает объединенный ответ на внешнее действие механических сил. Признаков отторжения каркасов нет. Заполнение каркаса клетками и коллагеном влияет на строение регенерата, при этом регенерат заполнил весь объем импланта во всех случаях.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На основе цифровой 3D-модели ушной раковины человека разработана конструкция объемного изделия — комбинированного тканеинженерного скаффолда в форме ушной раковины. Скаффолд был успешно воспроизведен посредством полимерной 3D-печати и исследован в эксперименте на минипигах. Уникальность и объемность изделия обусловлены особенностями расположения ребер жесткости из полилактида, которые повторяют контуры козелка, противокозелка и завитка ушной раковины, а также формами и расположением полиуретановых гироидных сеток. За счет впечатывания нитей сеток в полилактид, удалось избежать провисания сеток, и получить механически прочный полимерный каркас, пригодный для имплантации в живой организм. Между нитями гироидных сеток находятся сообщающиеся открытые пространства. Эти свободные пространства могут быть искусственным путем заполнены гидрогелем на основе коллагена, гидрогелем с живыми клетками, а также оказались доступными для естественного спонтанного врастания регенератов из окружающих тканей при имплантации скаффолда в живой организм под височную фасцию.

Использование данных технологий позволило решить ряд технических проблем, на которые указывает множество зарубежных исследований, связанных с контролем контура, механической прочностью и стабильностью формы биоинженерного эндопротеза [21].

Имплантация скаффолда под височную фасцию модельного животного инициировала развитие соединительнотканных регенератов, источником роста которых были соединительнотканные анатомические структуры (преимущественно височная фасция) окружающие имплант. Регенерат внутри импланта имеет собственную сосудистую сеть, обеспечивающую жизнеспособность клеток и сохранность биологических структур внутри всего объема скаффолда ушной раковины.

Строение скаффолда определило возможности роста и особенности регенерационного и адаптивного ремоделирований живых тканей и сосудов, заполнивших скаффолд. Успешность интеграции полученного не рассасывающегося каркаса в живой организм обусловлена в значительной степени совпадением механических характеристик импланта (скаффолд несет функцию внутреннего «скелета» уха) и живых тканей, к которым он прикреплен. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетания ребер жесткости с гироидными сетками. Установлено, что строение волоконного остова регенерата подстраивается под форму конструкции, что обеспечивает объединенный ответ тканеинженерной конструкции, позволяющий сохранять целостность живых тканей и каркаса при внешних механических воздействиях.

Обнаружено, что заполнение каркаса клетками и коллагеном влияет на строение регенерата. Это может быть принято во внимание при дальнейшем совершенствовании тканеинженерной конструкции ушной раковины и разработке новых способов ее имплантации и реконструкции ушной раковины. Регенерат заполнил весь межполимерный объем скаффолда во всех случаях, а достижение заполнения конструкции эластическим хрящом может быть целью дальнейших исследований. 

ВЫВОДЫ

В исследованиях на живых биологических моделях скаффолд в форме полноразмерной ушной раковины показал свое преимущество перед контрольными образцами, обеспечив лучшую интеграцию и взаимодействие с живыми тканями, отсутствие воспаления и васкуляризацию, достаточную для жизнеобеспечения тканей внутри тканеинженерной конструкции. Необходима дальнейшая апробация импланта ушной раковины на биологических моделях, а разработанный метод изготовления имплантов перспективен и может послужить основой для создания отечественных пористых ушных имплантов на основе биосовместимых полимерных материалов, гидрогелей и аутологичного клеточного материала.