Профиль метилирования генома — это динамическая характеристика, способная меняться в процессе онтогенеза, а также под действием факторов окружающей среды. Метилирование происходит в последовательностях, богатых CpG-динуклеотидами, и осуществляется при участии ферментов ДНК-метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L) [1]. Метилтрансферазы DNMT3A и DNMT3B обладают de novo метилирующей активностью, а метилтрансфераза DNMT1 обеспечивает восстановление и поддержание ранее установленных метильных меток. При этом уровень метилирования каждого участка ДНК определяется двумя противоположно направленными процессами — метилированием и демитилированием, которые в целом зависят от активности ДНК-метилтрансфераз и ферментов с ДНКдиметилирующими свойствами [2].

Изменения экспрессии метилтрансфераз под действием ионизирующего излучения изучены в исследованиях in vitro на культурах клеток: в некоторых случаях эти изменения коррелируют с уровнем метилирования ДНК [3]. В экспериментах на мышах и тимицитах человека, предполагавших воздействие комбинированным облучением (низкие начальные дозы, с последующим облучением в высоких дозах), было выявлено снижение экспрессии генов DNMT2, DNMT3B, DNMT3L в тимоцитах мышей и DNMT2, DNMT3A в облученных in vitro тимоцитах человека [4]. У врачейхирургов, проводивших интервенционные вмешательства более трех лет, наблюдалось увеличение экспрессии ДНКметилтрансфераз [5]. Одним из регуляторов изменения экспрессии метилтрансфераз в ответ на действие ионизирующего излучения является белок р53, который непосредственно связывается с ДНК. При облучении уменьшается его прямое связывание, что приводит к увеличению транскрипционной активности гена DNMT1 [6].

Показано, что на радиочувствительность клеток, в том числе стволовых клеток, влияют уровень метилирования генома и активность метилтрансфераз. Это обусловлено тем, что активность метилтрансфераз и метилирование отдельных участков ДНК потенциально могут изменять секрецию таких факторов, как TNFα, NO и TGFβ [7]. Кроме того, метилирование и изменение экспрессии генов метилтрансфераз под действием ионизирующего излучения способствует индукции нестабильности генома [8].

В связи с этим целью настоящего исследования было изучить экспрессию мРНК генов ДНК-метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию (преимущественно с низкой мощностью дозы). 

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили образцы периферической крови, полученные от 112 жителей прибрежных сел р. Течи, подвергшихся хроническому радиационному воздействию вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов ПО «Маяк». Внутреннее облучение было сформировано за счет радионуклидов, поступивших в организм с речной водой и продуктами местного производства, а внешнее γ-излучение  — за счет загрязнения радионуклидами донных отложений и пойменных почв.

Массированные сбросы радиоактивных отходов начались в 1950 г. В первые годы основными источниками облучения были короткоживущие радионуклиды.

Затем в результате защитных мероприятий и распада короткоживущих радионуклидов мощность дозы внешнего облучения, а также внутреннего облучения мягких тканей существенно снизилась: после 1960 г. она не превышала 10^–5 Гр/год для всех, кто проживал на прибрежных территориях. Несколько иной была картина облучения красного костного мозга (ККМ), поскольку главный вклад в формирование дозы вносил долгоживущий остеотропный 90Sr, обеспечивающий хроническое облучение с монотонно снижающейся мощностью дозы, которая к 1985 г. стала ниже 10–5 Гр/год у всех облученных людей [9].

Критерии включения людей в исследуемые группы: постоянное проживание в одном из 41 села, расположенных на побережье р. Течи, в период с 1 января 1950 г. по 31 декабря 1960 г.; наличие рассчитанных индивидуальных накопленных поглощенных доз облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов на основе дозиметрической системы Techa River Dosimetry System-2016 (TRDS-2016) [10]. Критерии исключения: наличие аутоиммунных, острых или хронических (период обострения) воспалительных заболеваний, прием антибиотиков, глюкокортикоидов и цитостатических препаратов в течение последних шести месяцев до момента взятия образца крови.

В зависимости от величины накопленной дозы облучения ККМ участников исследования условно разделили на группу сравнения (67 человек), в которой значения доз облучения ККМ не превышали 70 мГр за весь период жизни, и группу хронически облученных лиц (45 человек), чьи дозы превышали 70 мГр.

Средняя накопленная доза облучения ККМ у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, составила 782,0 ± 82,3 мГр (диапазон доз 77,8–3179,7 мГр), а среднее значение мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (1950–1951 гг.) составило 145,7 ± 16,3 мГр/год (диапазон мощностей доз 0,1–542,6 мГр/год). Средняя накопленная доза облучения тимуса и периферических лимфоидных органов была равна 93,2 ± 13,6 мГр (диапазон доз 2,8–644,8 мГр), при этом средняя мощность дозы облучения в период максимального радиационного воздействия составила 42,8 ± 6,8 мГр/год (диапазон мощностей доз 0,1–320,9 мГр/год). Средняя накопленная доза облучения ККМ в группе сравнения была равна 20,7 ± 2,7 мГр  (диапазон доз 1,3–63,2 мГр), а средняя накопленная доза облучения тимуса и периферических лимфоидных органов составила 8,8 ± 1,6 мГр (диапазон доз 0,2–33,5 мГр).

Средний возраст хронически облученных лиц составил 72,2 ± 0,7 года (63–83 года), а возраст лиц из группы сравнения — 63,7 ± 1,0 года (54–79 лет). В двух группах подавляющее большинство образцов было получено от женщин. Так, в группе хронически облученных людей доля женщин составила 70,1% (47 человек); в группе сравнения — 68,9% (31 человек).

Кровь для оценки относительного содержания мРНК метилтрансфераз отбирали из локтевой вены в стерильные вакуумные пробирки Tempus Blood RNA Tubes (Thermo Scientific; США) в объеме 3 мл. Выделение РНК осуществляли колоночным методом при помощи коммерческого набора GeneJET Stabilized and Fresh Whole Blood RNA Kit (Thermo Scientific; США). Качественные и количественные характеристики выделенных образцов общей РНК оценивали при помощи спектрофотометра NanoDrop 2000С (Thermo Scientific; США). Чистоту препарата определяли по значениям поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (А260/280). Реакцию обратной транскрипции проводили отдельным этапом с использованием коммерческого набора реактивов MMLV RT Kit («Евроген»; Россия). Относительное содержание мРНК определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием амплификатора Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories; USA). Олигонуклеотидные последовательности праймеров и зондов был разработаны компанией ООО «ДНК-СИНТЕЗ» (Россия) (табл. 1).

Реакцию ПЦР-РВ проводили в следующем временном режиме: предварительная денатурация при температуре 95 °С в течение 5 мин, циклическая денатурация при 95 °С в течение 20 с, отжиг праймеров и элонгация при 65 °С в течение 60 с (50 циклов). Для каждого образца ставили по три реплики.

Относительную продукцию генов рассчитывали по методу 2^–ΔΔCt [11]. В качестве эндогенного контроля использовали ген «домашнего хозяйства» ACTB. Расчет проводили с помощью программного обеспечения прибора Real-Time CFX96 Touch (BioRad; США).

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программного комплекса SPSS Statistics 17.0 (IBM; США) и Graph Pad Prism 8.4.3 (GraphPad Software Inc.; США). Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. При описании выборок для данных, подчиняющихся законам нормального распределения, использовали среднее арифметическое значение (М), с указанием ошибки среднего (± SE) и диапазона значений (min–max). При описании показателей, распределение которых отличалось от нормального, использовали медиану (Ме) и 25–75-й процентили (Q₁–Q₃). Сравнение выборок данных проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни, поскольку распределение большинства значений было отличным от нормального. Корреляционный анализ для оценки влияния дозовых характеристик на количественные показатели относительного содержания мРНК генов метилтрансфераз проводили путем расчета коэффициентов ранговой корреляции (R) по Спирмену. Для всех критериев и тестов различия признавали значимыми при p < 0,05. При 0,05 < p < 0,1 различие считали  тенденцией к значимому различию.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При сравнении двух выборок не были выявлены статистически значимые различия относительного содержания мРНК генов метилтрансфераз DNMT1, DNMT3A, DNMT3B (табл. 2).

В результате корреляционного анализа в объединенной выборке были обнаружены слабые положительные связи между относительным содержанием мРНК гена DNMT1 и величиной накопленной дозы облучения ККМ (R = 0,19; p = 0,04), тимуса и периферических лимфоидных органов (R = 0,19; p = 0.05), а также величиной мощности дозы облучения ККМ (R = 0,21; p = 0,02), тимуса и периферических лимфоидных органов (R = 0,20; p = 0,04) в период максимального радиационного воздействия (табл. 2).

Зависимость относительного содержания мРНК гена DNMT1 от дозовых характеристик была исследована методом регрессионного анализа в объединенной выборке. Анализ подтвердил наличие закономерности изменения экспрессии мРНК гена DNMT1 в зависимости от величины мощности доз облучения ККМ (R = 0,20; p = 0,03), тимуса и периферических лимфоидных органов (R = 0,19; p = 0,04) в период максимального радиационного воздействия. Не обнаружена зависимость относительного содержания мРНК генов DNMT3A и DNMT3B от дозовых параметров (табл. 3).

У лиц с накопленными дозами облучения ККМ более 1000 мГр (1044,8–3179,7 мГр) наблюдается значимое увеличение экспрессии мРНК гена DNMT1 (среднее значение — 1659,0 ± 155,7; p = 0,02) относительно группы сравнения (рисунок А).    

Кроме того, отмечено, что относительное содержание мРНК гена DNMT1 было  значимо  выше (p = 0,04) у людей с накопленными дозами облучения тимуса и периферических лимфоидных органов от 103,9 до 644,8 мГр (среднее значение — 200,9 ± 30,3 мГр) по сравнению с лицами, чьи дозы не превышали 10,0 мГр (среднее значение — 2,5 мГр) (рисунок Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

DNMT1 — одна из основных ДНК-метилтрансфераз в клетках млекопитающих. Она представляет собой большой и высокодинамичный фермент с множеством регуляторных функций, которые могут контролировать метилирование ДНК. В частности, его экспрессия необходима для поддержания паттерна метилирования ДНК во время митоза. Кроме того, DNMT1 играет непосредственную роль в восстановлении эпигенетической информации во время репарации ДНК [8].

Повышение экспрессии гена DNMT1 часто бывает связано с тотальным гипометилированием [12]. Стоит отметить, что подобный эффект гипометилирования генома был зафиксирован у работников атомной индустрии, подвергшихся комбинированному воздействию излучений с высокой и низкой ЛПЭ. Группа исследователей [13] отметила, что у рабочих с суммарной накопленной дозой, превышающей 103,14 мЗв, уровень метилирования генома существенно выше такового при более низких уровнях облучения (менее 103,14 мЗв), что указывает на дифференциальный характер ответа эпигенома на воздействие низких и высоких доз.

В другой работе этого же коллектива авторов также показано снижение общего уровня 5-метилцитозина в лейкоцитах крови работников, подвергшихся воздействию γ-излучения и рентгеновского излучения [14].

Изменение экспрессии ДНК-метилтрансфераз зачастую бывает связано с локус-специфичным изменением метилирования генов, ответственных за поддержание клеточного гомеостаза. В работе [15] было рассмотрено гиперметилирование СpG-островков промоторов некоторых генов (в частности, p16/INKA и GSTP1) в нормальных лейкоцитах крови в отдаленный период после радиационного воздействия. Дальнейшие обследования работников ПО «Маяк» с индивидуальными рассчитанными накопленными дозами внешнего воздействия γ-излучения или комбинированного действия внешнего γ-/внутреннего α-излучения, выполненные с расширением спектра анализируемых локусов, выявили совокупность генов p16/ INKA, р53, GSTP1, SOD3, АТМ, ESR1, гиперметилирование которых ассоциировано с радиационным воздействием [16].

В проведенных нами ранее исследованиях была отмечена положительная корреляционная связь между уровнем метилирования промоторного региона гена ATM и дозой облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов у облученных лиц [17]. Кроме этого, экспрессия гена ATM была значимо снижена в группе хронически облученных людей с дозами облучения ККМ, превышающими 1000 мГр [18].

Не исключено, что в отдаленные сроки после начала хронического облучения человека при дозах облучения ККМ более 1000 мГр изменение экспрессии гена DNMT1 может быть вовлечено в индукцию эпигенетических нарушений. Для того чтобы ответить на вопрос, действительно ли DNMT1 принимает участие в эпигенетических механизмах, необходимо изучить влияние транскрипционной активности гена на уровень метилирования промоторных регионов генов, регулирующих репарацию, пролиферацию и гибель клеток у лиц, подвергшихся радиационному воздействию.

ВЫВОДЫ

В отдаленные сроки после начала хронического низкоинтенсивного облучения человека в диапазоне доз более 1 Гр наблюдается значимое повышение экспрессии мРНК гена DNMT1. У хронически облученных лиц регистрируют положительные корреляционные связи экспрессии мРНК гена DNMT1 с дозой облучения красного костного мозга, тимуса и периферических лимфоидных органов, а также мощностью дозы облучения этих органов в период максимального радиационного воздействия (1950–1951 гг.).