Со времен открытия гибридомной технологии получения моноклональных антител Кёллером и Милстейном в 1975 г. [1] созданы, испытаны, зарегистрированы, применены и выведены из употребления сотни диагностических и терапевтических антител [2]. Первые зарегистрированные терапевтические антитела Muromonab-CD3 были получены гибридомной технологией в мыши [3]. Следующим этапом развития технологии получения терапевтических антител стала гуманизация мышиных иммуноглобулинов — частичная или полная, ставшая возможной в результате прогресса технологии рекомбинантных ДНК [4]. Примерно в то же время, когда на человеке испытывали первые мышиные терапевтические антитела, был создан фаговый дисплей — сначала пептидов [5], а потом и антител [6]. Этот метод стал, пожалуй, самым мощным инструментом создания и «улучшения» терапевтических антител, постепенно вытеснившим гибридомную технологию [2, 7]. Альтернатива фаговому дисплею появилась в результате развития технологии секвенирования отдельных клеток, когда стало возможным получение моноклональных антител человека путем клонирования вариабельных фрагментов антител из определенного клона плазматических клеток [8].

Одно из самых перспективных направлений медицинского применения моноклональных антител человека — получение терапевтических нейтрализующих антител (нАт) и использование их для профилактики и лечения социально значимых инфекционных заболеваний. Особую актуальность приобрела разработка вируснейтрализующих антител против возбудителя новой коронавирусной инфекции в период пандемии COVID-19 [9]. С начала пандемии COVID-19 было разработано, испытано в клинических исследованиях и зарегистрировано в FDA и у других регуляторов более 20 различных нАт. Появление новых вариантов SARS-CoV-2 привело к тому, что большинство нАт потеряли свою эффективность, вместе с тем ряд нАт показали широкую нейтрализующую активность в отношении наиболее распространенных вариантов Омикрона [8, 11]. Несмотря на существенное уменьшение доли тяжелого течения COVID-19, нАт по-прежнему остаются самым эффективным средством этиотропной терапии, особенно актуальной в когорте онкогематологических пациентов и пациентов с другими первичными и вторичными иммунодефицитами [12].

Цель настоящего обзора — на примере разработки вируснейтрализующих антител против SARS-CoV-2 осветить современное состояние проблемы получения рекомбинантных антител человека.

Фаговый дисплей антител

Метод фагового дисплея антител был независимо разработан несколькими научными группами, первой из которых стала группа McCafferty из Кембриджского университета [6]. Суть метода заключается в создании фаговой библиотеки, содержащей все возможные варианты вариабельных участков иммуноглобулинов. Это достигается путем клонирования антигенсвязывающих последовательностей антител в последовательность поверхностного белка pIII филаментных бактериофагов M13, fd или f1, в результате чего создается некоторое количество уникальных клонов, каждый из которых презентирует на своей поверхности вариабельный фрагмент определенной специфичности. Дальнейшие этапы технологии включают скрининг фагов и отбор по тому или иному полезному свойству, например по коэффициенту аффинности связывания с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе с последующим клонированием отобранных последовательностей в векторы для экспрессии антител [6]. Фаговая библиотека может быть создана из вариабельных участков последовательности иммуноглобулинов иммунизированного животного или человека, а может представлять собой и случайный набор синтетических пептидов [13].

Преимуществом фагового дисплея, по сравнению с другими аналогичными технологиями, такими как рибосомный дисплей [14], дрожжевой дисплей [15] или дисплей в клетках млекопитающих [16], является то, что библиотеки с разнообразием уникальных клонов больше чем 1011 могут быть созданы и продолжительно сохранены в состоянии, готовом для скрининга с любой панелью антигенов [7]. Вариабельные фрагменты антител в фаговых библиотеках могут существовать в нескольких форматах: в виде антиген-связывающих Fab-фрагментов [17] или однодоменных scFv-фрагментов (single chain fragment variable) [18, 19]. ScFv — моновалентные фрагменты антител, имеющие молекулярную массу 25–27 кДа и состоящие из вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей иммуноглобулинов, соединенных пептидным линкером [20]. Fab — относительно большие фрагменты иммуноглобулинов, состоящие из VH, VL, CL, и CH1 доменов. Преимущество scFv — в более высоком уровне экспрессии в фагах по сравнению с Fab, однако в формате scFv всегда существует некоторый риск потери аффинности при переводе в Fab или в полноразмерный IgG [7]. Среди других вариантов фаговых библиотек антител однодоменные антитела (человека VH, верблюдовых VHH и акул VNAR соответственно), которым ниже посвящен отдельный раздел.

Методом фагового дисплея антител были получены нАт против ВИЧ [21], токсина сибирской язвы [22], клещевого энцефалита [23] и, конечно, против SARS-CoV-2 [24]. В последнем исследовании продемонстрировано, что высокоаффинные нейтрализующие антитела против S-белка SARS-CoV-2 с показателем ID₅₀ < 2 нг/мл могут быть получены методом фагового дисплея из полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов наивных антител. Создание правильной библиотеки CDR наивных В-клеток, таким образом, является ключевым параметром, обеспечивающим стабильное спаривание VH и VL доменов и, как следствие, получение высокоаффинных нейтрализующих антител [24]. Вместе с тем, следует отметить, что данная проблема успешно решается далеко не всеми и подавляющее большинство высокоактивных нАт получено из образцов гипериммунных реконвалесцентов [8].

Из недостатков фагового дисплея канонических олигомерных антител следует отметить, что получаемые антитела, как правило, не соответствуют естественному репертуару, поскольку генерируются из случайных пар VH и VL. Одним из вариантов решения проблемы спаривания VH/VL доменов является использование фаговых библиотек однодоменных антител семейства верблюдовых — так называемых нанотел [25, 26].

Однодоменные антитела как платформа для создания терапевтических иммунопрепаратов методом фагового дисплея

Однодоменные антитела, или нанотела, — рекомбинантные вариабельные домены тяжелых цепей VHH, получаемые из неканонических иммуноглобулинов, Fab-фрагмент которых состоит только из укороченной тяжелой цепи, без легкой цепи. В норме такие антитела присутствуют у хрящевых рыб и представителей семейства верблюдовых (Camelidae) в дополнение к «классическим» иммуноглобулинам G, состоящим из двух тяжелых и двух легких цепей [25]. Основное преимущество нанотел заключается в том, что VHH-домен, представленный одной полипептидной последовательностью, может быть легко клонирован в прокариотической или дрожжевой системах экспрессии. Размер нанотела составляет 12–15 кДа, они хорошо растворимы и способны к рефолдингу после очистки в денатурирующих условиях [25]. Повышенная растворимость VHH связана с особенностями их аминокислотного состава. По сравнению с обычными антителами, у которых интерфейс, обеспечивающий спаривание VH и VL доменов обогащен остатками гидрофобных аминокислот, у VHH в гомологичных участках гидрофобные аминокислоты заменены на более гидрофильные, что повышает растворимость рекомбинантных продуктов за счет уменьшения склонности к агрегации [27].

Небольшой размер и однодоменная природа позволяют нанотелам проникать в структуры, недоступные для полноразмерных антител и связывать эпитопы, стерически экранированные для обычных антител [25, 28–30]. Успешное преодоление стерических ограничений однодоменными антителами обусловлено еще и тем, что петля, содержащая CDR3 регион в VHH-домене, длиннее, чем у обычных антител, что позволяет первым связывать антигены, расположенные, например, в каталитических расщелинах ферментов или в трехмерных конгруэнтных участках лиганд-рецепторного взаимодействия [7]. Благодаря большей мобильности, в частности, у SARS-CoV-2, однодоменные антитела могут распознавать RBD S-белка в неактивной «down»конформации и нарушать переход в открытую «up»конформацию, делая S-белок нефункциональным [31] (см. далее).

Аффинность однодоменных антител находится в том же диапазоне, что и у обычных антител, состоящих из тяжелой и легкой цепей, но при этом нанотела, в отличие от классических антител, обладают высокой стабильностью в широком диапазоне ионных сил, рН и температуры [32]. Производство нанотел в бактериях обходится дешевле, чем производство классических антител. Вследствие высокой гомологии каркасных участков однодоменных VHH верблюдовых и VH доменов подкласса IgG3 человека, первые могут быть легко гуманизированы без потери функциональных свойств [25]. Все перечисленное создает предпосылки для исследований и применения рекомбинантных однодоменных антител как для целей диагностики, так и для терапии [33, 34].

Би- и триспецифические/валентные нанотела

Вследствие малого размера однодоменные антитела характеризуются быстрой кинетикой в системном кровотоке и элиминацией через почки в течение нескольких часов. С одной стороны, это является преимуществом, например, при создании радиоизотопных диагностических инструментов [26], с другой стороны, ограничивает применение нанотел в качестве профилактических и терапевтических агентов и требует дополнительных усилий по увеличению периода их полувыведения из кровотока. Проблема быстрой системной элиминации нанотел решается путем их олигомеризации и/или создания би- и триспецифичных антител. С помощью гетеродимеризации и создания би- и тривалентных нанотел их фармакокинетика может быть существенно пролонгирована. В качестве примера можно привести гетеродимерное биспецифическое нанотело ALX0061, полученное компанией Ablynx и состоящее из высокоаффинного VHH-домена, связывающего рецептор IL6 с коэффициентом аффинности 0,19 пМ, и VHHдомена, специфичного к сывороточному альбумину. За счет последнего обеспечивается период полувыведения гетеродимерного комплекса, равного 6,6 суток, при молекулярной массе первого 26 кДа [35], и это явно не предел. Столь высокая аффинность нанотела ALX-0061 — продукт «аффинного созревания», выполненного также с помощью фагового дисплея, в результате которого удалось получить 200-кратное увеличение аффинности, по сравнению с исходным VHH-доменом [35]. Еще один пример терапевтического антитела на основе гетероолигомеризации нанотел — препарат Ozoralizumab, представляющий собой гуманизированное биспецифичное тривалентное антитело, состоящее из двух VHH-доменов, связывающих TNFα, и одного VHH-домена, связывающего сывороточный альбумин [36]. Введение в состав би- и тривалентных антител VHHдомена, связывающего сывороточный альбумин, можно считать одним из стандартных подходов по увеличению периода полувыведения рекомбинантных нанотел [37].

Создание би- и тривалентных антител путем олигомеризации VHH-доменов не только имеет значение для увеличения периода полувыведения этих антител, но и сопровождается повышением их функциональности за счет увеличения авидности таких антител [38]. Еще одним вариантом повышения полужизни и функциональной активности нанотел является создание белков слияния с Fc-фрагментом иммуноглобулинов человека. Модификация нанотел Fc-фрагментом существенно увеличивает период полужизни в кровотоке, а также способствует включению Fc-опосредованных эффекторных функций (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, комплемент-зависимая цитотоксичность и т. д.) [39, 40].

Вируснейтрализующие нанотела

В допандемийную эпоху разными группами исследователей были получены терапевтические нейтрализующие нанотела против респираторного синцитиального вируса [41], MERS-CoV [42], пандемических вариантов вируса гриппа: H1N1 [43], H5N1 [44], а также мультидоменные широконейтрализующие нанотела против вируса гриппа, связывающие гемагглютинин [45]. С началом пандемии SARS-CoV-2 эти технологические разработки были применены для создания нейтрализующих нанотел против нового возбудителя. Так, с помощью технологии дрожжевого дисплея [46] были получены синтетические нейтрализующие нанотела mNb6-tri против S-белка SARS-CoV-2. Показано, что эти нанотела, связываясь с S-тримером в «down»-конформации, стабилизируют его в этой неактивной форме и таким образом делают невозможным взаимодействие c ACE2 [31]. В результате генноинженерной оптимизации тривалентные антитела mNb6-tri приобрели фемтомолярную аффинность и пикомолярную концентрацию полной вирус-нейтрализации SARS-CoV-2. Данные антитела сохраняют функциональность после лиофилизации, нагревания, перевода в аэрозоль и  могут быть применены в ингаляционной форме для вирус-нейтрализации в бронхоальвеолярном дереве [31].

Получена панель RBD-специфичных нанотел из библиотеки фаговых дисплеев VHH, созданных из В-клеток бактрийского верблюда, иммунизированного рекомбинантным RBD [47]. С помощью теста вируснейтрализации in vitro были отобраны три клона (P2C5, P5F8 и P2G1), полностью подавлявшие цитопатический эффект SARS-CoV-2 при концентрациях 12–48 нМ. Для улучшения противовирусных свойств антител были получены гомодимерные и гетеродимерные формы клонов нанотел, показавшие в 100 и более раз высокую вируснейтрализующую активность, по сравнению с мономерами [47].

В свете возникновения новых вариантов SARSСoV-2, характеризующихся повышенной способностью избегания вируснейтрализующих антител, очень актуальны подходы по созданию широконейтрализующих антител, связывающих все возможные варианты SARS-CoV-2. По крайней мере один подход реализован с помощью технологии однодоменных антител. Группа исследователей иммунизировали ламу поочередно S-белком SARS-CoV-1 и MERS-CoV, после чего получили фаговую библиотеку вариабельных доменов антител и провели скрининг в том числе против S-белка SARS-CoV-2. В результате получено нанотело VHH72, характеризующееся высокой кросснейтрализующей активностью по отношению к SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Авторы создали бивалентное антитело на основе VHH72 в виде белка слияния с Fc-фрагментом Ig человека и показали его перспективность в качестве кандидата для создания широконейтрализующего противовирусного препарата [48]. С помощью фагового дисплея и VHH получены и другие вируснейтрализующие нанотела, инактивирующие SARS-CoV-2 [49].

Таким образом, с помощью технологии однодоменных антител получен ряд перспективных гомо- и гетеродимерных нАт, которые являются многообещающими кандидатами для создания этиотропного препарата для лечения и профилактики COVID-19.

Получение рекомбинантных антител человека из отдельных B-клеток

Самый современный с исторической и методологической точек зрения подход к получению моноклональных антител человека заключается в прямом выделении специфичных В-клеток с последующим секвенированием геномов отдельных клеток и идентификацией вариабельных фрагментов, продуцируемых ими мАт [50]. Этот подход имеет три варианта, различающихся методологией первого этапа (идентификация и наращивание антигенспецифического клона В-клеток). Например, с помощью гибридомной технологии можно получить гибридомы целевых В-клеток с миеломными клетками и провести селекцию на среде HAT с последующим отбором гибридом нужной специфичности (1); либо выделить, культивировать и отобрать В-клетки памяти (2); либо напрямую выделить В-клетки памяти с целевым BCR, взаимодействующим с флюоресцентно или магнитно меченым антигеном, с последующим анализом репертуара специфичных клонов В-клеток с помощью технологии single cell sequence (3). Последний вариант является самым современным и технологичным и позволяет за сравнительно короткое время получать панели специфичных нАт [8]. Антигенспецифичные В-клетки памяти могут быть получены из плазмы гипериммунных пациентов или от трансгенных мышей, несущих локусы иммуноглобулина человека и продуцирующих полностью человеческие антитела в ответ на иммунизацию целевым антигеном [51]. С целью сделать скрининг отдельных антителопродуцирующих клеток высокопроизводительным применяют различные технологические решения, например, микрофлюидную сортировку В-клеток с оценкой специфичности BCR с последующим бар-кодированием пар VH и VL и высокопроизводительным секвенированием [52].

Преимуществом новой технологии является то, что ее результат не зависит от разнообразия библиотеки вариабельных доменов, но при этом всегда является вариантом естественного репертуара антител, вследствие чего характеризуется приемлемым профилем безопасности и существенно меньшей вероятностью неспецифичных (off-target) взаимодействий с собственными антигенными детерминантами [50]. Применение высокопроизводительных технологических решений наряду с NGS-секвенированием в формате единичных клеток позволяет одномоментно анализировать сотни различных клонов В-клеток памяти, секретирующих антитела заданной специфичности, и производить отбор по различным полезным признакам (аффинность, авидность, перекрывание антигенных эпитопов и пр.) [8, 52].

Подход, основанный на получении нАт из отдельных клонов В-клеток путем single cell sequence, показал свою высокую эффективность при создании широконейтрализующих антител, блокирующих сайт связывания CD4 в областях V1/V2 и V3 gp120, а также gp41 ВИЧ [53, 54]. Кроме того, с помощью данной технологии были получены мАт против цитомегаловируса [55] S-антигена вируса гепатита В (HBsAg) [56] и большое количество нАт против S-белка SARS-CoV-2 [57–60].

С помощью технологии анализа отдельных В-клеток от иммунизированных гуманизированных мышей и реконвалесцентов после COVID-19 были получены одни из первых вируснейтрализующих антител REGN10933 (casirivimab) и REGN10897 (imdevimab) [58]. С помощью NGS-секвенирования и 3D-картирования антигенных эпитопов методом HDX-MS (от англ. hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry) была проанализирована панель из более чем 200 вируснейтрализующих антител, из которых в итоге отобрано четыре антитела, характеризующихся неперекрывающимися эпитопами. Применение пар этих антител в коктейле позволило эффективно нейтрализовать все известные на тот момент варианты SARS-CoV-2.

В 2021 г. было проведено аналогичное исследование по созданию панели вируснейтрализующих антител против SARS-CoV-2 [8]. В результате NGS-секвенирования клонов В-клеток пациентов, тяжело перенесших COVID-19, получено 18 высокоаффинных антител к RBD с KD в диапазоне 0,47–13,3 нМ и обладающих вируснейтрализующей активностью, причем четыре из них характеризовались 100%-й вируснейтрализацией при концентрации ниже 16 нг/мл [8]. Далее проводили конкурентный анализ взаимодействия полученных антител с панелью коммерчески доступных нейтрализующих антител, для которых известна 3D-структура антигенного эпитопа. Кроме уже упомянутых REGN10933 (casirivimab) и REGN10897 (imdevimab) [58], можно назвать еще COVA2-15 [59] и COV2-2504 [60]. Результаты конкурентного анализа, а также серии экспериментов по вируснейтрализации RBD SARS-CoV-2 с известными точечными мутациями позволили достаточно точно идентифицировать антигенные эпитопы полученных ультранейтрализующих антител. Комбинирование взаимодополняющих антител позволило подобрать коктейли нАт, обеспечивающие эффективную нейтрализацию всех исследованных вариантов SARS-CoV-2. Этот опыт показывает, что получение из индивидуальных В-клеток памяти исчерпывающей панели широконейтрализующих антител, перекрывающей все возможные антигенные эпитопы и обеспечивающей избегание точечных мутаций, может позволить быстро подбирать эффективные вируснейтрализующие коктейли против любых новых вариантов SARS-CoV-2. При необходимости, панель широконейтрализующих антител может быть дополнена с помощью направленного мутагенеза антигенсвязывающих участков.

Создано несколько микрофлюидных платформ, значительно увеличивающих производительность клонирования и экспрессию отдельных антител. Одной из них является платформа 10x Genomics, в которой в микрофлюидном устройстве генерируются капли, содержащие по одной антителопродуцирующей клетке, а также лизирующий буфер с микрошариками, покрытыми бар-кодированными праймерами, для кодирования кДНК конкретных нативных пар VH и VL доменов [61].

Недавно была разработана LIBRA-seq (от англ. linking B cell receptor to fntigen specificity through sequencing) — технология высокопроизводительного скрининга BCR путем связывания В-лимфоцитов с баркодированными с помощью олигонуклеотидов антигенами с последующим NGS-секвенированием [62]. Она позволила провести скрининг антигенной специфичности нескольких тысяч В-клеток ВИЧ-инфицированных пациентов и подтвердить предсказанную специфичность для антител к ВИЧ, гриппу и SARS-CoV-2, включая известные и неизвестные нАТ.

Получаемые с помощью технологии single B-cell мАт могут быть точно так же генноинженерно модифицированы, как и антитела, полученные фаговым дисплеем. Так, возможна модификация Fc-фрагмента для увеличения циркуляции антител в кровотоке. Среди наиболее продвинутых модифицированных антител против SARSCoV-2 можно отметить антитело сотровимаб (известное так же как VIR-7831 и GSK4182136), разработанное Vir Biotechnology и GlaxoSmithKline, одобренное FDA в 2021 г. Fc-фрагмент сотровимаба включает аминокислотные замены M428L и N434S (модификация LS) для пролонгирования периода полувыведения [63]. Другим примером является AZD7442, коктейль из антител к SARS-CoV-2 нАт tixagevimab (AZD8895) и Cilgavimab (AZD1061) [64], разработанный AstraZeneca. Оба нАт в комбинации имеют сконструированные Fc-домены, включающие замены L234F/L235/P331S (модификация TM), что приводит к незначительному связыванию или его полному отсутствию с различными FcyRs или белком комплемента C1q и незначительной эффекторной функции in vitro [64] или ее отсутствию.

Применение искусственного интеллекта как перспектива дальнейшего развития технологий создания антител человека

На роль принципиально новой технологии получения антител человека уже сейчас может претендовать вычислительная технология прогнозирования структуры антител in silico с помощью искусственного интеллекта [65]. Созданная в 2021 г. нейросеть AlphaFold2 позволяет прогнозировать пространственную структуру белков по первичной последовательности с атомарной точностью [66]. AlphaFold2 — это первый успешный пример применения машинного обучения для моделирования третичной структуры белка. AlphaFold2 использует так называемое множественное выравнивание последовательностей MSA (от англ. multiple sequence alignment), анализируя информацию о спаривании аминокислотных остатков и структурные шаблоны для первичной последовательности [67].

Специально для предсказания 3D-структуры антител и антигенных эпитопов был разработан сервис AbAdapt, объединяющий структурное моделирование антител и антигенов с моделированием их взаимодействия. По умолчанию AbAdapt принимает первичные последовательности в качестве входных данных и использует Repertoire Builder [68] — высокопроизводительный сервис моделирования структуры антител. В 2022 г. с помощью объединения AlphaFold и AbAdapt была разработана система AbAdapt-AF [69], более точно предсказывающая структуру паратопов и антигенных эпитопов, специфичных для антител. Авторы применили разработанный сервис для анализа вирус-нейтрализующего антитела к RBD домену SARS-CoV-2 и показали, что их система наилучшим образом моделирует антиген–антительное взаимодействие. Недавно созданные специализированные нейросети Ablooper [70] и DeepAb [71] показали большую производительность, чем сети Rosetta Antibody Benchmark и AlphaFold2.

В августе 2022 г. была представлена нейросеть NanoNet, оптимизированная для предсказания 3D-структуры VHH [72]. Ее архитектура состоит из сверхточной нейросети (CNN) с двумя дополнительными нейросетями (ResNet). Первая ResNet анализирует каркасы и гипервариабельные циклы CDR, а вторая воспринимает взаимодействия между аминокислотными остатками. Сравнение NanoNet с AlphaFold2 по предсказанию 3D-структуры известных 16 VHH, депонированных в PDB в 2021 г., т. е. отсутствующих в обучении AlphaFold2, продемонстрировала более высокую атомарную точность NanoNet. Таким образом, NanoNet представляет собой весьма многообещающий новый инструмент для моделирования структуры VHH, нашедший применение в том числе для оптимизации предсказаний структуры петель CDR3 нейтрализующих VHH против SARS-CoV-2 [73].

Можно заключить, что уже сейчас существует теоретическая возможность создания высокоаффинных вариабельных доменов антител in silico — без использования В-клеток и иммунизации. Несомненно, в будущем подбор высокоаффинной последовательности к конкретным антигенным эпитопам с помощью машинного обучения станет рутинным методом получения антител человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Технологии получения моноклональных вируснейтрализующих антител человека в настоящее время базируются на применении фагового дисплея антител и технологии получения антител из отдельных В-клеток. Каждая из технологий имеет свои преимущества и ограничения. С помощью фагового дисплея можно быстро осуществлять скрининг фаговых библиотек с последовательностями антигенсвязывающих участков по отношению к новым антигенам. Технология однодоменных антител VHH позволяет создавать би- и триспецифичные антитела, оптимизировать аффинность и вируснейтрализацию новых вариантов SARS-CoV-2. Технология получения антител из отдельных В-клеток, усиленная высокопроизводительным скринингом на основе микрофлюидики и NGSсеквенирования, сделала возможным создание панелей вируснейтрализующих антител, комбинирование которых способно «перекрывать» любые модификации RBD SARS-CoV-2. Перспективы развития технологии получения моноклональных антител включают применение нейросетей и машинного обучения для прогнозирования первичной структуры вариабельных доменов антител по третичной структуре целевого антигена.