Некардиогенный отек легких (НКОЛ) — жизнеугрожающее критическое состояние, под которым подразумевают, прежде всего, синдром острого легочного повреждения и его наиболее тяжелую форму — респираторный дистресссиндром [1], а также тяжелую двустороннюю пневмонию. Эти состояния характеризуются быстрым развитием гипоксемии и гипоксии, устойчивой к кислородотерапии [2, 3]. НКОЛ может развиться в результате отравления пульмонотоксикантами (что нередко происходит в условиях пожаров, химических аварий и других экстремальных ситуаций), либо на фоне вирусной или бактериальной пневмонии [3, 4], септического или геморрагического шока, полиорганной недостаточности и других причин [5]. Механизмы развития этих процессов различаются: токсический отек легких (ТОЛ) обусловлен первичным повреждением альвеолярно-капиллярной мембраны [4], кардиогенный — повышением давления крови более чем на 30 мм рт. ст. в малом кругу кровообращения.

Пульмонотоксические эффекты проявляют вещества, повреждающие альвеолярные мембраны легких — фосген, хлор, диметилсульфат, оксиды азота и серы, аммиак, кислоты, тиомочевина и другие летучие токсиканты [6, 7]. Вдыхание паров или аэрозолей некоторых токсикантов (дихлорэтан, трихлорэтилен и др.) ведет к отеку легких смешанного типа, имеющего сходство как с токсическим, так и с кардиогенным отеком легких [8]. Общие механизмы повреждения альвеолярно-капиллярных мембран лежат также в основе развития отека легких, вызываемого вирусными и бактериальными инфекциями [5]. 

Основное направление терапии ОРДС — обеспечение адекватного газообмена посредством подбора условий респираторной поддержки [9]. В терапии НКОЛ используют метод гипербарической оксигенации [10] и другие методы респираторной поддержки [9, 11], а также некоторые группы лекарственных препаратов — ганглиоблокаторы (например, пентамин), наркотические анальгетики (морфин), сердечные гликозиды (строфантин, дигоксин), диуретики (лазикс), кортикостероиды (преднизолон), пеногасители [12, 13], антигипоксанты [14]. Еще в качестве фармакологических средств терапии ТОЛ предложены седативные препараты, такие как кетамин, центральные α2-адреномиметики, бензодиазепины и др. [15].

Продолжается разработка новых подходов к терапии ТОЛ. Так, последние годы в этой связи вызывают внимание блокаторы аквапорина-5 [16], инновационные технологии с использованием перфторуглеродных жидкостей [17], рекомбинантные белки теплового шока (в том числе в сочетании с легочным сурфактантом) [18, 19].

Однако однозначно эффективных средств и методов предотвращения и лечения ТОЛ, вызванного пульмонотоксикантами, до сих пор не разработано [20, 9]. Летальность пострадавших с ТОЛ достигает 60%  даже в условиях стационара, причем подавляющее большинство из этого числа гибнут в течение трех суток после воздействия токсиканта [5, 6].

Таким образом, разработка новых, более эффективных противоотечных препаратов является актуальной задачей для современной медицины.

Среди потенциальных средств для лечения НКОЛ представляет интерес N,N-диэтил-5,5-дифенил-2пентиламина гидрохлорид (ДДПА), синтезированный в ФГБУН ИТ ФМБА России. Фармацевтическая субстанция зарегистрирована и выпускается ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России, № Р N002888/01 от 06.06.2008. Структурная формула активного вещества приведена на рисунке (рисунок).

Фармако-токсикологическая оценка ДДПА представлена ранее [21]. ДДПА является активным Н-холинолитиком, обладает выраженной спазмолитической и противовоспалительной активностью, местноанестезирующим действием, улучшает микроциркуляцию крови, а также проявляет антиоксидантное и мембраностабилизирующее действия. Согласно имеющимся данным [21], ДДПА оказывает положительный эффект при ингаляционных поражениях пульмонотоксикантами и раздражающими веществами, что позволяет ожидать его эффективность при ТОЛ. На это также указывают ранее опубликованные данные [22], показавшие лечебный эффект ДДПА на модели некардиогенного отека легких.

Целью работы было исследовать лечебную эффективность ДДПА на моделях токсического отека легких у животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Фармацевтическая субстанция N,N-диэтил-5,5-дифенил2-пентиниламина гидрохлорида (ДДПА) предоставлена ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России с чистотой 99,7%. В работе использовали реактивы марки «хч» и «чда».

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах (возраст три месяца, вес 200–220 г), полученных из питомника «Рапполово» (Лен. обл., Рапполово, Россия; ветсвидетельство № 15806716021). Животных содержали в стандартных условиях при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные были отобраны в эксперимент методом рандомизации.

Моделирование отека легких и дизайн экспериментов

Для моделирования острого НКОЛ у крыс использовали две методики. В первом случае отек легких вызывали внутрибрюшинным введением тиомочевины, а во втором — ингаляцией диоксида азота [5].

Методика индуцирования НКОЛ путем введения тиомочевины

Внутрибрюшинно вводили крысам тиомочевину в виде 10%-го водного раствора в дозе 100 мг/кг.  Сразу после этого с целью усиления легочной гипоксии животных помещали в ингаляционную камеру вместимостью 100 л и выдерживали 30 мин в атмосфере, содержащей монооксид углерода в концентрации 1500 мг/м³. Концентрацию СО в камере контролировали с помощью автоматического газоанализатора. Эксперимент проводили на 80 самцах беспородных крыс, распределенных на две группы: группу контроля (без лечения) и группу, прошедшую лечение ДДПА. Через 1 ч из каждой группы рандомно выбирали по 20 животных, у которых определяли макроскопическую картину легких, легочный коэффициент (ЛК), сухой остаток легких в процентах (СОЛ), степень гидратации легких в процентах (СГЛ). Остальных 40 животных использовали для оценки выживаемости. Результаты представлены в табл. 1.

Методика индуцирования НКОЛ путем ингаляции NO₂

В ходе эксперимента клетки с животными помещали в ингаляционную камеру вместимостью 100 л и подавали из баллона диоксид азота в составе воздушно-газовой смеси. Экспериментальных крыс в количестве 10 особей рассаживали в четыре клетки по 2–3 особи в каждую. Концентрацию NO₂ в камере контролировали с помощью газоанализатора «MONOLIT» («Норд-Вест Инжиниринг»; Россия). Параллельно контролировали в камере концентрацию СО₂ (с помощью газоанализатора ПКУ-4/1-МК-С, Россия) и О₂ (с помощью газоанализатора ПКГ-4-К-Н-1-М, Россия), поддерживая параметры в пределах физиологической нормы. После установления в ингаляционной камере заданной концентрации NO₂ выдерживали крыс в камере в течение 18 мин, общее время ингаляции составляло 20 мин. Отклонения концентрации NO₂ в камере не превышали 5% от заданной.

В ходе предварительных экспериментов были установлены токсические концентрации диоксида азота, которые составили LC20/20 мин = 180 мг/м³, LC50/20 мин = 210 мг/м³ и LC80/20 мин = 225 мг/м³.  В этих экспериментах было использовано 40 животных.

После выбора токсических концентраций были проведены эксперименты по изучению лечебного действия ДДПА в условиях ТОЛ. В первом эксперименте с использованием 60 животных было изучено влияние ДДПА на выживаемость крыс в условиях трех затравочных концентраций диоксида азота (табл. 2). Во втором эксперименте на 72 животных были изучены параметры внешнего дыхания и определены гравиметрические коэффициенты легких у выживших особей после затравки диоксидом азота в концентрации LC50/20мин = 210 мг/м³ (табл. 3 и табл. 4).

Введение препарата и оценка результатов лечения

Сразу после завершения процедуры индуцирования НКОЛ животных делили на две группы. Животным первой группы ингаляционно вводили ДДПА в виде 1%-го водного раствора, а второй (группы контроля) аналогично вводили чистую воду. Время ингаляции раствором ДДПА составляло 2 мин. Через 1 ч проводили повторную ингаляцию раствором ДДПА. Для экспериментов применяли компрессорный ингалятор (небулайзер) «OMRON NE-C28 PLUS» (Китай) с производительностью 0,5 мл/мин. Средняя дисперсность частиц генерируемого аэрозоля составляла 1,5 мкм, диапазон распределения аэрозольных частиц составлял от 0,2 до 10 мкм.

Оценку результатов лечения проводили на основе сравнения с группой контроля. В соответствии  с общими диагностическими критериями оценки тяжести отека легких у лабораторных животных [23] оценивали выживаемость, состояние животных,  клиническую картину интоксикации, макроскопические поражения легких и гравиметрические коэффициенты легких. Параметры внешнего дыхания крыс измеряли на полиграфе М150Р (BIOPAC Sistems; США): частоту дыхания в минуту (ЧД); объем вдоха в милилитрах (ОВ). Оценку параметров внешнего дыхания и гравиметрических показателей проводили до затравки (фон) и в сроки 2 ч и 5 ч после затравки. Оценку гравиметрических показателей проводили только у выживших животных, которых выводили из эксперимента путем декапитации по 12 особей.

Для оценки выраженности НКОЛ использовали следующие гравиметрические параметры: легочный коэффициент (ЛК), сухой остаток легких (СОЛ) и степень гидратации легких (СГЛ), которые рассчитывали по формулам 1–3.

форм. 1

m₁ — масса свежих легких опытного животного (г);

m₂ — масса опытного животного (г).

форм. 2

m₁ — масса свежих легких опытного животного (г);

m₃ — масса высушенных легких опытного животного (г).

форм. 3

m₁ — масса свежих легких опытного животного (г);

m₄ — масса свежих легких интактных особей (г).

Массу высушенных легких m₃ определяли, высушивая свежие легкие животного в сушильном шкафу при 100 °С до постоянного веса.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с использованием описательной статистики, подсчитывая средние значения и стандартные ошибки среднего, рассчитанные на основе стандартного отклонения. Полученные данные проверяли на нормальность по методу Шапиро–Уилка. При доказательстве нормальности распределения показателей в экспериментальных группах и равенства дисперсий применяли использование методов параметрической статистики с помощью t-критерия Стьюдента, используя компьютерную программу «StatPro». Различия считали достоверными при p < 0,05 [24, 25].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В табл. 1 представлены результаты лечения НКОЛ, вызванного внутрибрюшинным введением тиомочевины, у крыс.

После индуцирования НКОЛ для дальнейшего наблюдения животных помещали в клетку содержания. Через 40–60 мин от момента введения раствора тиомочевины у всех животных отмечали гиподинамию и регистрировали одышку. В дальнейшем состояние животных контрольной группы продолжало прогрессивно ухудшаться: появлялась одышка с участием вспомогательной мускулатуры, адинамия, цианоз, взъерошенность шерсти. В итоге часть животных в контрольной группе погибала; гибель наступала в течение 1,5–2,0 ч в условиях нарастающей острой дыхательной недостаточности. В ходе дальнейшего наблюдения гибель животных не наступала. У животных, которые получали в качестве терапии 1%-й раствор ДДПА сразу после ингаляции, состояние стабилизировалось, и в дальнейшем ухудшения со стороны дыхательной системы не происходило. У животных регистрировали двигательную активность, груминг.

При оценке макроскопической картины легких у выведенных из эксперимента животных легкие были увеличены в объеме, на разрезе паренхимы наблюдалось отделение жидкости бордового цвета. В грудной полости отмечалось наличие экссудата темно-красного цвета в объеме до 5 мл. В группе, в которой животным применяли терапию ДДПА, выпот в плевральной полости был светло-желтого цвета, без геморрагического компонента.

Результаты, полученные при изучении эффективности лечения НКОЛ, индуцированного диоксидом азота, представлены в табл. 2–табл. 4.

В табл. 4 представлены гравиметрические коэффициенты легких, регистрируемые у животных в различные сроки (2 ч и 5 ч) после отравления в сравнении с интактными животными.

Клиническая картина ТОЛ после затравки животных диоксидом азота

Сразу после затравки в камере с NO₂ у животных наблюдали гиподинамию и одышку. В дальнейшем состояние животных ухудшалось: появлялись одышка с участием вспомогательной мускулатуры, адинамия, цианоз, взъерошенность шерсти. Гибель животных наступала в условиях нарастающей острой дыхательной недостаточности. На вскрытии легкие павших животных были заполнены вспененной жидкостью. Гибель животных наступала в обеих группах, как без лечения, так и леченых, однако в первые 5 ч состояние животных, получавших ингаляции ДДПА, стабилизировалось, в отличие от группы контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Представленные в табл. 1 результаты лечения НКОЛ, вызванного внутрибрюшинным введением тиомочевины, свидетельствуют о снижении степени отека легких. В группе животных, которым проводили ингаляции ДДПА, отсутствуют случаи гибели и наблюдается статистически значимое уменьшение гравиметрических коэффициентов легких. Оценка весовых показателей легких у животных показывает, что введение препарата тормозит нарастание уровня гидратации [24], что снижает степень отека легких.

Согласно результатам лечения НКОЛ, вызванного ингаляцией NO₂ (табл. 2), лечение ДДПА снижает летальность по сравнению с контролем. Положительный эффект ДДПА наиболее выражен на фоне интоксикации средней концентрацией LC50/20 мин = 210 мг/м³ в период 2–5 ч после затравки. Кроме того, ДДПА увеличивал продолжительность жизни крыс: значимые отличия от контроля выявлены в условиях интоксикации низкой и средней концентрации NO₂ (LC50/20 мин = 210 мг/м³). При лечении ДДПА снижается частота дыхания (ЧД) и увеличивается объем вдоха (ОВ) через 5 ч по сравнению с контрольной группой. Гравиметрические коэффициенты легких (табл. 4) свидетельствуют о торможении процесса легочной гидратации у животных, получавших ДДПА. Значимые различия по сравнению с контролем получены для легочного коэффициента (ЛК), по остальным показателям выявлена тенденция к снижению гидратации легких.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности проводимой терапии ДДПА на использованных моделях ТОЛ. Вопрос о механизме реализации лечебного эффекта ДДПА пока остается открытым, Как можно предположить из имеющихся данных о фармакологии ДДПА, его эффект, вероятно, имеет комбинированную природу. Благодаря своим спазмолитическим свойствам ДДПА может снижать давление в малом круге кровообращения, что в сочетании с противовоспалительным, мембраностабилизирующим и антиоксидантным действием, очевидно, уменьшает гидратацию легких.

При этом следует отметить, что результаты лечения ТОЛ, индуцированного внутрибрюшинным введением тиомочевины лучше, чем отека, вызванного ингаляцией NO₂. Данное различие можно объяснить тем, что двуокись азота приводит к более глубоким и необратимым повреждениям легочной ткани, чем тиомочевина. Тиомочевина быстро выводится из организма, не образуя устойчивых аддуктов, и ее повреждающее действие заканчивается практически сразу после снижения ее концентрации в крови. Напротив, двуокись азота вступает в реакции с тканью легких, образуя токсичные метаболиты и инициируя деструктивные процессы на протяжении длительного периода после интоксикации. В связи с этим токсический отек легких, вызванный NO₂, крайне трудно поддается лечению.

ВЫВОДЫ

В ходе проведенного исследования установлено, что ингаляция раствора ДДПА оказывает лечебный эффект на двух моделях токсического отека легких. На модели ТОЛ, вызванного внутрибрюшинным введением тиомочевины, эффективность лечения ДДПА более выражена, чем на модели NO₂-индуцированного ТОЛ. Полученные результаты, при экстраполяции данных на человека, позволяют заключить, что применение ДДПА может быть перспективно при поражении пульмонотоксикантами, в плане сохранения жизни пострадавшему на догоспитальном этапе и при транспортировке в стационар на лечение.