Актуальной задачей современной радиобиологии является поиск маркеров индивидуальной радиочувствительности в контексте реализации отдаленных эффектов облучения [1–3]. Одним из наиболее значимых эффектов воздействия ионизирующих излучений на человека является радиационно-индуцированный канцерогенез, патогенетические механизмы которого в настоящее время активно исследуют. Повышенный риск онкопатологии в отдаленные сроки после радиационного воздействия отмечается в разных когортах людей: у лиц, переживших атомные бомбардировки [4], ликвидаторов радиационных аварий [5], в когортах профессионалов [6], у проживающего на радиационно загрязненных территориях населения [7, 8]. В частности, в когорте облученных на реке Тече лиц выявлены повышенные риски заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей и лейкозов [9].

Идентификация и верификация маркеров предрасположенности к развитию радиационноиндуцированной онкопатологии важна для оптимизации подходов к формированию групп повышенного риска в когортах людей, пострадавших в результате облучения, с целью максимально полного медицинского наблюдения за лицами c повышенным риском развития злокачественных новообразований (ЗНО) [2]. Показатели иммунитета, в первую очередь, характеризующие состояние Т-клеток, в отдаленные сроки после радиационного воздействия могут быть рассмотрены в качестве таких маркеров. Так, у жителей сел, расположенных вдоль побережья реки Течи, перенесших хронический лучевой синдром (ХЛС), через 65 лет после начала облучения отмечено снижение абсолютного количества CD3⁺, CD4⁺ и CD8⁺лимфоцитов в периферической крови и повышение сывороточных концентраций IL4 и ФНОα по сравнению с людьми аналогичного возраста и пола, облученными в сопоставимых дозах, но не имевших ХЛС в анамнезе [10].

В контексте патогенетических механизмов радиационноиндуцированного канцерогенеза гетерогенная субпопуляция Т-регуляторных клеток (Treg или CD3⁺CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺- лимфоциты [11]) представляет особый интерес. Фактор транскрипции FOXP3 специфичен для Treg и обеспечивает контроль дифференцировки и функционирования этой субпопуляции лимфоцитов [12]. Определение уровней этого белка может быть перспективно в качестве одного из потенциальных маркеров предрасположенности к развитию радиационно-индуцированной онкопатологии человека в отдаленном периоде после хронического радиационного воздействия с преимущественным поражением центрального органа гемопоэза — красного костного мозга (ККМ). Ген FOXP3 доминантно контролирует функцию Treg, а его непрерывная экспрессия гарантирует сохранение полной супрессивной способности этих клеток [11]. Фактор транскрипции FOXP3 репрессирует транскрипцию IL2, повышает экспрессию CD25 и других маркеров Treg. Механизмы Treg-опосредованной супрессии до сих пор обсуждают, но известно, что регуляция экспрессии белка FOXP3 критически важна для контроля иммунных реакций, включая противоопухолевый надзор [12].

В норме белок FOXP3 взаимодействует с ключевыми транскрипционными факторами T-лимфоцитов, включая NFAT, NFkB и AML1/Runx1 и др. Экспрессию гена FOXP3 контролирует транскрипционная и эпигенетическая регуляция. Изменение экспрессии гена FOXP3 приводит к смене фенотипа Т-клеток и изменению их функций [12]. У человека экспрессия гена FOXP3 в большинстве CD4⁺-Tклетках может быть вызвана продолжительной стимуляцией T-клеточного рецептора. При этом большинство FOXP3⁺ T-клеток имеют низкий уровень фактора FOXP3 [12]. Транскрипция гена FOXP3 может быть инициирована в эффекторных Т-клетках при распознавании антигена в процессе воспаления [13]. За счет способности к ингибированию противоопухолевого иммунитета Treg способствуют развитию и прогрессированию опухолей. Высокая инфильтрация опухолевой ткани Treg клетками связана с плохой выживаемостью пациентов при различных типах ЗНО [14]. Регуляторные функции Treg, инфильтрирующих опухоль, осуществляются посредством сигнального пути COX2 / PGE2 [15]. В настоящее время Treg активно изучают как потенциальные терапевтические мишени при онкотерапии [14], однако исследования модулирующих эффектов ионизирующих излучений на фенотип и функции Treg-клеток, включая экспрессию гена FOXP3, концентрации и функциональную активность фактора транскрипции FOXP3, в доступной научной литературе представлены в ограниченном объеме [16].

Пластичность субпопуляции Treg, участие фактора транскрипции FOXР3 в дифференцировке Treg, а также роль регуляторных Т-клеток в радиационноиндуцированном канцерогенезе определяют актуальность количественного исследования белка FOXР3 в мононуклеарах периферической крови у людей из когорты реки Течи.

Целью данной работы было исследование влияния радиационного воздействия, пола, возраста на момент обследования и этнической принадлежности на концентрацию белка FOXP3 в лизатах митогенстимулированных мононуклеарных клеток периферической крови у хронически облученных жителей прибрежных сел реки Течи в период реализации канцерогенных эффектов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование образцов крови сельских жителей, постоянно проживающих в прибрежной зоне реки Течи и подвергшихся хроническому низкоинтенсивному облучению преимущественно за счет остетропных радионуклидов (ККМ — орган-мишень) проводили во ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России. Доза облучения каждого пациента была оценена с помощью дозиметрической системы TRDS-2016 [17].

Перед взятием крови пациенты в установленном порядке проходили медицинский осмотр. Критерии включения в исследование: отсутствие острых и хронических воспалительных заболеваний в стадии обострения; отсутствие почечной или печеночной недостаточности. Критерии исключения: приступы острого нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговые травмы в течение трех месяцев до исследования; наличие подтвержденных онкологических и аутоиммунных заболеваний; наличие курсов гормоно-, антибиотико-, химио- и (или) радиотерапии; проведение медицинских процедур с применением ионизирующих излучений в течение шести месяцев перед исследованием.

В группу облученных людей (основная группа) были включены 30 человек в возрасте 67–80 лет, средний возраст которых составил 72,4 ± 0,5 года. Средняя накопленная доза облучения, рассчитанная на ККМ, у людей из данной группы составила 876 ± 136 мГр с диапазоном значений 87–3716 мГр. Средняя накопленная доза облучения, рассчитанная на тимус и периферические лимфоидные органы (ТиПЛО) — 125 ± 20 мГр с разбросом значений от 28 до 446 мГр.

Для изучения дозовых зависимостей основная группа пациентов была разбита на три группы пациентов с минимальными (0,07–0,49 Гр включительно), средними (0,50–0,84 Гр включительно) и высокими (0,85–3,72 Гр включительно) дозами облучения, рассчитанными на ККМ, по десять человек аналогичного возраста, пола и этноса в каждой группе. Статистически значимых различий по качественным характеристикам между тремя дозовыми группами и группой сравнения не обнаружено.

Группу сравнения составили 10 человек в возрасте 63–82 лет, не подвергавшихся радиационному воздействию в результате деятельности промышленных предприятий. Средний возраст людей в этой группе был равен 71,2 ± 2,0 года. Средняя накопленная доза облучения ККМ у людей из этой группы составила 27 ± 4 мГр с диапазоном значений 15–49 мГр. Средняя накопленная доза облучения ТиПЛО — 12 ± 3 мГр с интервалом значений 2–34 мГр.

В каждой группе преобладали женщины: 73,3% (22 человека) — в основной группе и 90,0% (9 человек) — в группе сравнения. В основной группе присутствовало 80,0% (24 человека) людей тюркской этнической группы, в группе сравнения — 70,0% (7 человек). Статистически значимые различия в возрастном, половом, этническом составе основной группы и группы сравнения не выявлены.

Образцы крови (4 мл) получали по стандартной технологии [18] из локтевой вены утром натощак в вакуэты, содержащие гепарин натрия. Фракцию мононуклеарных клеток (МНК) выделяли на градиенте плотности 1,077 г/см³ («Биолот»; Россия), дважды отмывали модифицированным по Дульбекко фосфатно-солевым буфером («Биолот»; Россия). Для инкубации МНК в течение 24 ч при 37,0 ± 0,5 °C использовали среду RPMI-1640 (HEPES 25 мМ, NaHCO₃ 24 мМ) («Панэко»; Россия) с витаминами («Панэко»; Россия), L-глутамином 2 мМ («Панэко»; Россия), в которую добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот»; Россия). В тестовую пробу МНК вносили фитогемагглютинин-П (ФГА) («Панэко»; Россия) в конечной концентрации 20 мкг/мл, в контрольную пробу МНК — равное раствору митогена количество воды очищенной. После стимуляции МНК осаждали, удаляли супернатант и хранили при минус 80 °C до следующего этапа. Оттаивание МНК проводили при температуре 2–8 °C, гемолиз примеси эритроцитов индуцировали охлажденным хлорида аммония раствором рН 7,27,4 [19]. МНК отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) (SigmaAldrich; США). Оценивали концентрацию клеток с помощью счетчика клеток «Countess II FL» (Thermo Scientific; США). Лизировали МНК, трижды замораживая при температуре минус 20 °С и размораживая пробы при комнатной температуре согласно рекомендациям производителя тест-системы для иммуноферментного анализа (ИФА). Количественно общий белок в лизатах клеток анализировали в реакции с бицинхониновой кислотой (тестсистема фирмы «Merck»; США) в 96-луночном планшете с помощью анализатора «Lazurite» (Dynex Technologies Inc.; США). Содержание фактора транскрипции FOXP3 в пробах определяли методом количественного ИФА (тестсистема фирмы «Blue gene»; Китай) на том же анализаторе с последующим пересчетом результата на 1 мкг общего белка в пробе.

При статистическом анализе данных использовали программное обеспечение SigmaPlot (демоверсия; SYSTAT Software, США). Гипотезу о нормальном распределении частот в выборках проверяли по критерию Колмогорова– Смирнова. Фактическое распределение частот отличалось от нормального во всех выборках. Для максимальной наглядности (медианное значение равно нулю в случаях, когда концентрация фактора транскрипции FOXP3 во всех или в большинстве исследуемых проб выборки была ниже предела количественного определения ИФА тест-системы) данные описательной статистики выражали как среднее арифметическое значение (M), ошибку среднего (m) и диапазон значений (min–max). Выборки данных сравнивали при помощи U-критерия Уилкоксона–Манна–Уитни. Качественные показатели — методом χ². Корреляционный анализ выполняли методом Спирмена. Статистическую значимость различий или связей оценивали при 95%-м уровне доверительной вероятности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты количественного определения фактора транскрипции FOXP3 в лизатах лимфоцитов после 24 ч инкубации с ФГА и без митогена представлены в таблице (таблица).

Не установлено статистически значимых различий при сравнении концентраций белка FOXP3 в лизатах МНК после 24 ч инкубации с ФГА и без митогена у обследованных людей из основной группы (до стимуляции: р = 0,349, после стимуляции р = 0,512), из трех дозовых подгрупп (до стимуляции: р = 0,706, р = 0,257, р = 0,450; после стимуляции: р = 0,940, р = 0,326, р = 0,597 в порядке возрастания дозы облучения ККМ в подгруппе) и группы сравнения.

Вариация индивидуальных значений внутриклеточной концентрации фактора транскрипции FOXP3 в группах хронически облученных лиц с разными накопленными дозами облучения после митогенной стимуляции МНК in vitro несколько выше, чем в группе сравнения.

При анализе дозовых зависимостей не выявлено статистически значимых связей между концентрацией фактора транскрипции FOXP3 в исследуемых лизатах симулированных (SR = 0,13; р = 0,414) и не стимулированных (SR = 0,18; р = 0,263) митогеном МНК в течение 24 ч и дозами облучения, рассчитанными на ККМ, а также на тимус и периферические лимфоидные органы (до стимуляции: SR = 0,23, р = 0,183; после стимуляции: SR = 0,09, р = 0,602).

Корреляционный анализ Спирмена не выявил влияния пола (до стимуляции: SR = –0,08, р = 0,609, после стимуляции: SR = –0,03, р = 0,856), возраста на момент обследования (до стимуляции: SR = 0,02, р = 0,915; после стимуляции: SR = 0,11, р = 0,484), этнической принадлежности (до стимуляции: SR = 0,05, р = 0,767; после стимуляции: SR = –0,01, р = 0,966) на исследуемые показатели у обследованных людей из основной группы и из группы сравнения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Особенностью радиационно-индуцированного канцерогенеза является длительный период реализации эффекта, что может быть обосновано дополнительным влиянием комплекса факторов нерадиационной природы на организм облученного человека, в том числе и факторов риска развития ЗНО. В организме, облученном в сублетальных дозах, включаются компенсаторно-приспособительные механизмы, адекватное функционирование которых препятствует, в частности, онкотрансформации нормальных клеток [10]. Иммунокомпетентные клетки являются основными эффекторами противоопухолевого иммунного надзора, нарушение их функций — один из ключевых аспектов патогенеза ЗНО [20].

У практически здоровых жителей сел, расположенных вдоль техногенно загрязненной радионуклидами поймы реки Течи и подвергшихся многолетнему низкоинтенсивному воздействию ионизирующих излучений вследствие производственной деятельности ПО «Маяк», в отдаленном периоде после начала облучения обнаружены стойкие изменения иммунного статуса, наиболее выраженные со стороны Т-звена иммунитета. Сообщается о снижении количества лейкоцитов (в основном, за счет нейтрофилов и лимфоцитов) в периферической крови, повышении лизосомной активности нейтрофилов, некоторой супрессии внутриклеточного кислород-зависимого метаболизма моноцитов [1] и смещении баланса системы цитокинов в сторону провоспалительного ответа [21].

Регуляторные Т-клетки, c одной стороны, могут напрямую ингибировать активность цитотоксических Т-клеток, с другой стороны — эти клетки могут рекрутированы или индуцированы онкотрансформированными клетками и клетками микроокружения опухоли, что позволяет им избегать иммунной атаки. Treg-лимфоциты могут препятствовать активации и дифференцировке CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток, индуцируют реактивность против аутологичных и опухолевых антигенов [11].

В микроокружении опухоли индукция и дифференцировка Treg происходят из Т-лимфоцитов с сильной иммунодепрессивной функцией, которые подавляют противоопухолевый иммунитет, способствуя возникновению и развитию опухолей. Treg из опухолевого микроокружения, в свою очередь, могут подавлять функцию иммунных эффекторных клеток с помощью различных механизмов и являются важными факторами уклонения опухоли от иммунного надзора [22–25]. Treg микроокружения опухоли могут секретировать TGFβ, IL10 и IL35 [26], которые угнетают противоопухолевый иммунный ответ, подавляют антигенную презентацию в дендритных клетках, функцию Т-хелперов и генерируют опухолеспецифичные CD8⁺цитотоксические Т-лимфоциты. Цитокины IL10 и IL35 поразному экспрессируются субпопуляциями Treg клеток микроокружения опухоли и синергически способствуют истощению внутриопухолевых Т-клеток, регулируя экспрессию нескольких ингибирующих рецепторов [27]. Treg способны к непосредственному цитолизу других клеток за счет секреции перфорина и гранзимов, а также синтезируют и продуцируют циклический аденозинфосфат, влияя на метаболизм других клеток [11, 14].

Экспериментальные данные, полученные на мышах, свидетельствуют об увеличении доли опухолевых и селезеночных Тreg после локального облучения в дозах 10 и 20 Гр и снижении общего количества CD4⁺FOXP3⁺-Treg в лимфатических узлах после общего облучения мышей в дозе 1,25 Гр [28].

При воздействии ионизирующего излучения жизнеспособность CD4⁺-лимфоцитов человека дозозависимо уменьшается. Отмечена более высокая радиорезистентность Treg по сравнению с CD4⁺лимфоцитами и зависимое от дозы снижение экспрессии гена FOXP3 в Treg человека при дозах облучения 0,940 Гр и 1,875 Гр. Натуральные (nTreg) и TGFβ-индуцированные (iTreg) регуляторные T-клетки проявляют повышенную устойчивость к облучению в дозе 10 Гр по сравнению с обычными CD4⁺-лимфоцитами. Через 48 ч после облучения клеток в дозе 10 Гр экспрессия гена FOXР3 снижается в nTreg и в iTreg (более выражено). Пониженная после облучения in vitro экспрессия гена FOXР3 в iTreg не влияет на дифференцировку в Т-хелперы первого или второго типа. В CD4⁺CD25⁺-iTreg экспрессия гена T-BET, участвующего в процессе дифференцировки клеток в Т-хелперы первого типа, была низкой до и после облучения в дозе 10 Гр, а экспрессия гена GATA3, участвующего в дифференцировке лимфоцитов в Т-хелперы второго типа, снижалась через 48 ч после такого облучения. Облучение изменяет экспрессию характерных молекул iTreg. При воздействии ионизирующего излучения в iTreg увеличивается экспрессия гена LAG-3, снижается экспрессия молекул CD25, CTLA-4, а также способность клеток угнетать пролиферацию CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов [16].

Полученные в настоящем исследовании данные позволяют говорить о сохранности в отдаленном периоде функционала Тreg-клеток, циркулирующих в периферической крови практически (или «условно») здоровых хронически облученных людей, в том числе процессов их дифференировки, реализуемых посредством гена FOXР3 и его ключевого фактора транскрипции — белка FOXР3. Это может быть обусловлено высоким адаптационным потенциалом иммунной и гемопоэтической системы человека, реализуемым в отдаленные сроки после хронического низкоинтенсивного радиационного воздействия с преимущественным поражением ККМ [1, 10, 21]. Однако представленные данные не позволяют исключать возможность аберрантных местных иммунных ответов с участием Тreg на этапе инициации ЗНО у облученных пациентов из групп повышенного онкологического риска. Данная проблема требует более детального изучения.

Результаты выполненного исследования не противоречат современным научным данным, но позволяют пополнить их сведениями о реакции МНК, выделенных из периферической крови хронически облученных людей на митогенную стимуляцию in vitro в период реализации канцерогенных эффектов облучения у изучаемой когорты населения.

ВЫВОДЫ

Значения концентрации факторов транскрипции FOXP3 в лизатах МНК через 24 ч инкубации с митогеном и без добавления ФГА статистически значимо не различались в группах хронически облученных и необлученных людей. Не выявлено влияния доз облучения ККМ, а также тимуса и периферических лимфоидных органов на внутриклеточные концентрации фактора транскрипции FOXP3 в МНК периферической крови человека после стимулирования митогеном. Статистически значимых взаимосвязей между полом, возрастом на момент обследования, этнической принадлежностью обследованных людей на концентрацию белка FOXP3 в лизатах митоген-стимулированных МНК не обнаружено. Высокая вариация у практически здоровых хронически облученных людей индивидуальных значений внутриклеточной концентрации фактора транскрипции FOXP3 после стимуляции МНК митогеном in vitro косвенно подтверждает гипотезу о наличии латентных и, по-видимому, компенсированных функциональных изменений в зрелых иммунокомпетентных клетках. Показатель может быть рассмотрен в качестве одного из потенциальных маркеров при оценке индивидуальной радиочувствительности человека в условиях хронического облучения в диапазоне малых и средних доз с преимущественным поражением ККМ. Необходимо продолжить работу по изучению ключевых факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке иммунокомпетентных клеток и обеспечивающих их функционирование в норме у хронически облученного населения, а также изучение их роли при радиационно-индуцированном канцерогенезе.