Антисептики относятся к одной из ключевых групп соединений, активно применяемых для профилактики и борьбы c инфекционными заболеваниями. Активность антисептиков связана с их способностью ингибировать рост (бактериостатический эффект) и инактивировать клетки микроорганизмов (бактерицидный эффект). Среди антисептиков одними из наиболее эффективных являются катионные соединения, которые электростатически связываются с отрицательно заряженными группами компонентов клеточных стенок бактерий, вытесняя стабилизирующие их двухвалентные катионы. Исследования антимикробной природы действия антисептиков выявили дезинтеграцию клеточной мембраны с последующим вытеканием внутриклеточных компонентов [1], нарушение клеточного метаболизма [2, 3], ингибирование ферментов, угнетение электронного транспорта и окислительного фосфорилирования [4, 5]. В частности, с помощью электронной микроскопии показаны специфические разрывы бактериальных клеточных стенок [6, 7].

Среди КА наиболее обширной группой веществ являются четвертичные аммониевые соединения (QAC) и бигуаниды [8]. Первые получили свое название за счет того, что в их структуре присутствует четвертичный азот с ковалентно присоединенным к нему гидрофобным заместителем [8]. К представителям негетероциклических QAC относится мирамистин (MIR), несущий один положительный заряд. Пространственная структура MIR обладает изогнутой формой и напоминает крюк, в котором голова наклонена к алкильному хвосту [9]. Предполагается, что положительно заряженный азот MIR взаимодействует с отрицательно заряженными фосфолипидами, что приводит к нарушению нормального распределения зарядов на поверхности мембраны, а гидрофобный хвост встраивается в бактериальные мембраны, результатом чего становится нарушение их физических и биологических функций. К представителям гетероциклических QAC относится антисептик октенидин (OCT), в структуре которого два пиридиновых атома азота соединены посредством длинного алкильного линкера, а в пара-положениях пиридиновых колец находятся остатки алкиламинов [10]. Несущий два положительных заряда OCT проявляет высокое сродство к липидам в составе бактериальной мембраны, особенно к отрицательно заряженному кардиолипину (CL). Бигуаниды относятся к виду соединений, где амидиновая группа присоединена к гуанидиновой c образованием –C=N–C=N– конъюгированной системы. Наиболее изученный представитель группы бигуанидов — хлоргексидин (CHL). В состав симметричной химической структуры CHL входят две соединенные гидрофобным линкером гидрофильные бигуанидиновые группы, к каждой из которых присоединено хлорфенольное кольцо. Для CHL характерна пространственная конформация в виде скобки [11]. При физиологических значениях рН молекула CHL несет два положительных заряда [10]. Большое распространение CHL получил благодаря антимикробной активности по отношению ко многим микроорганизмам, включая широкий ряд грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусы и грибы. Однако в отношении грамположительных бактерий CHL более эффективен. Некоторые виды грамотрицательных видов, такие как Proteus mirabilis (минимальная ингибирующая концентрация (МИК) составляет 115 мг/л), Providencia stuartii (МИК составляет 102 мг/л), проявляют высокую устойчивость по отношению к CHL [12].

Бактериальная плазматическая мембрана играет важную роль в функционировании клетки и выполняет множество функций, включая регуляцию транспорта веществ и участие в делении. Липиды, составляющие бактериальную плазматическую мембрану, варьируют по количеству и длине жирных кислот, количеству и расположению содержащихся в них двойных связей, структуре и заряду гидрофильной части [13]. Общими для большинства бактерий являются нейтральный фосфатидилэтаноламин (PE) и отрицательно заряженные фосфолипиды, фосфатидилглицерол (PG) и CL, составляющие по крайней мере 15% от общего содержания [14]. В отличие от PE и PG, CL имеет более массивную структуру за счет содержания в ней двух фосфатных остатков и четырех жирных кислот.

Для бактериальной плазматической мембраны характерно гетерогенное распределение липидов [15]. Фосфолипид PE распределен равномерно в клетках широкого ряда грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas putida, Azotobacter vinelandii, Proteus vulgaris), в то время как в клетках видов Bacillus показана его локализация в септальных участках [16]. Для анионных липидов показано формирование микродоменов. В частности, на полюсах клеток грамотрицательных бактерий в составе плазматической мембраны присутствуют микродомены из молекул CL. Считается, что локализация CL на полюсах связана с его участием в процессах клеточного деления, в частности, с взаимодействием с белками клеточного деления DnaA, MinD, FtsA. DnaA отвечает за инициацию репликации ДНК, MinD в составе системы MinCDE препятствует локализации дивисомы вблизи полюсов клетки, FtsA — бактериальный актин, линкерный белок для бактериального тубулина FtsZ, формирующего в середине клетки Z-кольцо. Данные белки реагируют преимущественно с анионными липидами бактериальной плазматической мембраны за счет наличия в своей структуре амфитропных мотивов, обогащенных положительно заряженными аминокислотами [17]. Другие важные клеточные процессы, в которых участвует CL за счет взаимодействия с белками — передача энергии, осмоадаптация и транслокация белков. С помощью рентгеноструктурного анализа продемонстрировано присутствие CL в структурах реакционного центра и цитохром-с-оксидазы Rhodobacter sphaeroides, формат- и сукцинат дегидрогеназы E. coli [13]. На E. coli показана колокализация CL с осмосенсорным транспортером ProP [18], реагирующим на изменение осмоляльности путем усиления транспорта в клетку органических осмолитов, а на Vibrio cholerae — колокализация с системой Eps, отвечающей за экспорт холерного токсина [19].

Несмотря на объем экспериментальных данных по механизмам действия катионных антисептиков, эти сведения не позволяют четко ответить на вопрос, что служит первопричиной бактерицидного действия антисептиков — дезинтеграция мембраны или угнетение клеточного метаболизма. Таким образом, точные молекулярные механизмы действия данной группы антимикробных веществ не до конца исследованы. Учитывая высказанные ранее предположения о возможной роли молекул CL как центров связывания КА [6], целью данной работы было исследовать влияние КА на CL-содержащие участки плазматической мембраны бактериальных клеток методами молекулярного моделирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Крупнозернистые молекулярные модели КА описаны ранее [20]. Для исследования влияния КА на модельный бислой были выбраны представители бигуанидов — CHL, пиклоксидин (PIC), QAC — (MIR, OCT). Все КА, кроме MIR, несут двойной положительный заряд. Химические структуры КА с разбиением их на крупнозернистые частицы в соответствии с силовым полем MARTINI представлены на рис. 1. Тип частиц С1 был выбран для описания гидрофобных участков КА по аналогии с параметризацией липидов, SC2/SC3/SC4 — для ароматических фрагментов, P5 — для фрагментов, содержащих пептидные связи, по аналогии с параметризацией аминокислот во второй версии силового поля MARTINI. Антисептики мы добавляли к модельному бислою при двух разных соотношениях КА : липид 1 : 8 и 1 : 4 в соответствии с концентрациями, применяемыми в медицинских растворах.

Молекулярную крупнозернистую модель бислоя мы создавали с помощью CHARMM-GUI MARTINI Maker [21], разработанного научной группой профессора Има в Лихайском университете (Lehigh University; США), в силовом поле MARTINI [22]. Модель плазматической мембраны, имитирующей липидный состав на полюсах бактериальной клетки, состояла из липидов пальмитоилолеил-PE (POPE), POPG и CL, несущих заряд -2 (CDL2), в соотношении 81 : 7 : 12 по массе. Расчеты крупнозернистой молекулярной динамики (МД) мы проводили с использованием программного пакета Gromacs 2019.4 (разработан в университетах Уппсалы и Стокгольма, а также Королевском Технологическом Институте, Швеция) [23] в течение 5 мкс для систем КА : липид 1 : 8 и в течение 35 мкс для систем КА : липид 1 : 4. Моделирование проводили в ансамбле NPT с использованием термостата V-rescale (T = 320 K; τt = 1 пс) и баростата Парринелло–Рамана (pref = 1 бар; τp = 12 пс) [23]. МД-расчеты мы выполняли с добавлением поляризуемой воды [24], c диэлектрической постоянной εr = 2,5, с шагом интегрирования 20 фс. Характеристики модельных бислоев в присутствии КА вычисляли с использованием встроенных утилит программного пакета Gromacs 2019.4. Площадь на липид была рассчитана с помощью gmx energy, коэффициенты латеральной диффузии — gmx msd. Профили плотности компонентов молекулярно-динамических систем относительно центра бислоя, радиальные функции распределения, оценка количества липидов вне плоскости бислоя мы оценивали с помощью программ, написанных нами на языке Python с применением функций библиотеки MDAnalysis. Значения толщины модельных мембран мы определяли по профилям плотности как разность положений пиков плотности фосфатов относительно центра бислоя. Характеристики модельных бислоев для каждой системы мы подсчитывали по двум последним мкс МД-траектории.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В присутствии всех исследованных КА наблюдалось снижение коэффициентов латеральной диффузии липидов (рис. 2А), незначительное снижение толщины бислоя (рис. 2Б) и увеличение площади на липид (рис. 2В). В присутствии всех типов КА, кроме MIR, отмечено снижение параметров порядка для жирнокислотных цепей липидов (данные не показаны), что можно объяснить принципиально другой химической природой MIR по сравнению с остальными КА. Обладая более длинными гидрофобными участками, молекулы MIR более глубоко проникали в модельный бислой и их взаимодействие с жирными кислотами приводило к упорядочиванию липидов в модельной мембране.

Добавление OCT в высокой концентрации способствовало формированию в бислое CL микродомена. При этом вначале происходило встраивание в бислой части молекул OCT с последующим стягиванием отрицательно заряженных липидов CL и PG в кластер. Часть молекул OCT, оставшаяся в «растворе», довольно быстро собиралась в один мицеллярный агрегат. Такое поведение молекул связано с большим числом гидрофобных участков в молекуле OCT (помимо терминальных концевых участков, между фрагментами пиридина присутствует длинный гидрофобный линкер). Мицеллярный агрегат сорбировался на молекулы OCT, находящиеся на сформированном CL микродомене (рис. 3А), и существовал в таком состоянии несколько микросекунд. При этом происходило нарушение симметричности расположения молекул POPE во внешнем и внутреннем монослое. Последнее подтверждается смещением пиков полярных голов липидов POPE во внешнем монослое относительно среднего положения фосфатов на профилях относительной плотности компонентов системы (рис. 3Б). Это происходит за счет того, что находящиеся рядом с CL доменом фосфаты полярных голов POPE липидов притягиваются к мицеллярному агрегату из молекул OCT. Начиная с момента времени примерно через 18 мкс МД расчета происходило постепенное вырывание молекул POPE, находящихся рядом с CL микродоменом (рис. 4А). Процесс вырывания длился около 2 мкс (рис. 4Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Плазматические мембраны грамотрицательных и грамположительных бактерий различаются по составу. Для наиболее изученных модельных видов в таблице (таблица) указаны соотношения между тремя преобладающими липидами. Из этих данных видно, что липид PE наиболее представлен в мембранах большинства видов грамотрицательных клеток по сравнению с грамположительными. Содержание CL, как правило, составляет не более 20% от общего количества, за исключением видов, в которых отсутствует PE. В плазматических мембранах таких видов содержание CL может достигать 50%.

На основании проведенных крупнозернистых МД расчетов нами показано, что все изученные КА встраиваются в модельный липидный бислой. Все исследованные КА снижали коэффициенты латеральной диффузии как нейтральных POPE, так и отрицательно заряженных липидов POPG и CDL2 (см. рис. 2A). Подвижность липидов жидкостно-мозаичных биологических мембран [25] играет важную роль для поддержания активности мембранных белков, участвующих во всех клеточных процессах, включая рост и дифференциацию клетки, транспорт веществ, клеточное дыхание. Подвижность липидов является мерой того, насколько легко данные биомолекулы могут перемещаться в плоскости бислоя, и оценивается через коэффициенты латеральной диффузии [26], которые могут быть получены из результатов молекулярной динамики [27]. Уменьшение коэффициентов латеральной диффузии до 20% от исходного уровня выявлено при соотношении концентраций антимикробное вещество : липид как 1 : 5 [28, 29], что может негативно влиять на функциональное состояние мембраны.

Наиболее заметно снижение латеральной диффузии проявлялось по отношению к липиду СDL2, обладающему большим отрицательным зарядом (–2 по сравнению с –1 у POPG) и более массивной структурой. Наиболее слабый эффект на снижение латеральной диффузии проявлял MIR. Это может быть связано с тем, что молекулы MIR, в отличие от остальных исследуемых КА, несут один положительный заряд и поэтому не способны связывать несколько липидов и образовывать протяженные участки относительно иммобилизованных липидов. Ярко выраженное замедление латеральной диффузии липидов в присутствии бигуанидов CHL и PIC также можно объяснить их химической природой. CHL и PIC, обладающие зарядом +2 и коротким линкером между заряженными частицами, способствовали формированию полужесткого каркаса, связывающего липиды в упорядоченные области в мембране.

При добавлении всех исследованных КА незначительно снижалась средняя толщина модельной мембраны и увеличивалась площадь, приходящаяся на одну молекулу липида (см. рис. 2). Все антисептики, за исключением MIR, нарушали упаковку жирных кислот липидов за счет расталкивания ацильных цепей своими встроенными в мембрану терминальными участками. Длинный хвост MIR напоминает по химической природе жирные кислоты липидов, поэтому его добавление приводило к упорядочиванию липидов в модельной мембране. Выявленные нами изменения в модельном бислое могут объяснять деструктивное действие антисептиков на функциональные и барьерные свойства плазматических мембран бактериальных клеток.

Антисептик OCT способствовал формированию в бислое CL микродомена, на который молекулы антисептика сорбировались в виде мицеллярного агрегата, вырывая из бислоя находящиеся рядом нейтральные липиды POPE. Подобные эффекты могут привести к наблюдаемому в эксперименте  увеличению проницаемости везикул при добавлении OCT. На основе полученных экспериментальных результатов [30] был предложен следующий молекулярный механизм бактерицидного действия OCT. На начальном этапе OCT связывается с наружной бактериальной мембраной, вследствие чего происходит нейтрализация поверхностного заряда. Гидрофобные участки OCT взаимодействуют с ацильными цепями липида А, в результате чего возникает гидрофобное несоответствие и нарушаются структура и целостность мембраны. Подобным образом молекулы OCT влияют и на плазматическую мембрану, вызывая ее деполяризацию, нарушение текучести и упаковки ацильных цепей фосфолипидов. В результате такого неспецифического действия в итоге обе мембраны клеточной стенки повреждаются, и внутриклеточное содержимое вытекает наружу. Полученные нами данные молекулярного моделирования о сорбции OCT на липидный бислой, снижении в присутствии OCT коэффициентов латеральной диффузии липидов и параметров порядка ацильных цепей подтверждают описанный в работе [30] механизм бактерицидного действия этого антисептика.

ВЫВОДЫ

На основе созданных крупнозернистых моделей КА из групп бигуанидов (CHL, PIC) и QAC (MIR, OCT) изучено их взаимодействие с CL-содержащим модельным бислоем, имитирующим состав плазматической мембраны на полюсах клеток палочковидных бактерий. Результаты МД-моделирования выявили как сходство, так и различие во влиянии различных КА на модельный бислой. При добавлении всех исследованных КА снижались коэффициенты латеральной диффузии липидов, незначительно уменьшалась средняя толщина мембраны и увеличивалось значение площади на липид. OCT при высокой концентрации способствовал образованию CL микродоменов с последующим вырыванием POPE липидов из модельной плазматической мембраны. Изучение взаимодействия КА с модельной бактериальной плазматической мембраной методами компьютерного моделирования позволило подтвердить на молекулярном уровне экспериментально установленные факты. Сравнение эффективности КА разной химической природы может оказать существенный вклад в создание новых эффективных препаратов и способствовать рациональному использованию антисептиков.