Cтафилококковые энтеротоксины, продуцируемые штаммами патогенных грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, вызывают у человека пищевые отравления различной степени тяжести [1–3]. Основной путь поступления стафилококковых энтеротоксинов в организм — алиментарный. В Российской Федерации, в соответствии с методическими указаниями Роспотребнадзора МУК 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах» и дополнению к ним (МУК 4.2.2879-11) [4, 5], токсикогенными считаются продукты, содержание токсина в которых равно или превышает 100 мкг/кг продукта. Такие же нормы установлены в США Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) [6]. Иммунохроматографический метод, наряду с твердофазным иммуноферментным анализом, широко применяется для выявления стафилококковых энтеротоксинов в сырье и готовых пищевых продуктах. Эффективность ИХТ была показана для выявления SEA [7], и SEA и SEB в продуктах питания [8]. Несомненные преимущества ИХТ — компактность аналитической системы, быстрота и простота процедуры проведения, возможность визуальной оценки результата. В то же время весьма актуальна задача повышения чувствительности анализа ИХТ. Подобные исследования проведены для выявления стафилококковых энтеротоксинов за счет применения ионов серебра и использования бифункциональных наночастиц золота [9, 10].

Учитывая вышеизложенное, цель настоящей работы — разработка отечественных ИХТ для выявления стафилококковых энтеротоксинов типов А и В, демонстрация возможности повышения чувствительности выявления указанных токсинов по сравнению с визуальной регистрацией результатов за счет использования видеоцифровых анализаторов иммунохроматограмм, действующих на основе обработки цифровых изображений иммунохроматограмм при освещении в различных спектральных диапазонах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Процедура изготовления ИХТ для выявления SEB и используемые для этого материалы описаны ранее [10]. ИХТ для выявления SEA конструировали при помощи аналогичного метода и использовали МКА, продуцируемые клонами 329D9B3, 329D9B3 и 329A11F6 в различных комбинациях (табл. 1). При изготовлении ИХТ для выявления SEB использовали МКА, продуцируемые клонами 357E10E9 и 357A8C1 (ФГБУ «48ЦНИИ» Минобороны; Россия). МКА S222, S643 произведены АО «ВНЦМДЛ» (Россия). В ИХТ использовали наночастицы коллоидного золота (НКЗ) со средним диаметром 30 нм, конъюгированные с МКА, а в качестве контаминанта — препарат SEB (ФГБУН «ГНЦ ПМиБ» Роспотребнадзора; Россия). Использовали также отечественные молочные продукты: молоко коровье 3,2% жирности (ГОСТ 31450-2013), сливки 10% жирности (ГОСТ 31450-2013), сметану 10% жирности термостатную (ГОСТ 31452-2012), сыр 50% жирности «Российский» (ГОСТ 314521-2012).

Пробоподготовку к анализу осуществляли следующим образом. Помещали 1 мл молочного продукта, содержащего токсин, в микроцентрифужную пробирку емкостью 2 мл, добавляли 50 мкл 0,5М цитратного буфера с рН = 3,0 и перемешивали кратковременным встряхиванием. Пробы центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин. Происходило расслоение пробы и осаждение молочного жира на дно пробирки. Верхний прозрачный слой жидкости в количестве 200 мкл отбирали и смешивали с 200 мкл концентрированного буфера для проведения иммунохроматографического анализа (ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России; Россия). Из полученной пробы отбирали 140 мкл и наносили на ИХТ. Для проб сыра поступали следующим образом. Навеску измельченного на мелкой терке сыра в количестве 1 г помещали в пробирку на 10 мл. Добавляли 1,0 мл стерильного физраствора, перемешивали в вибрационном встряхивателе в течение 1 мин при максимальных оборотах. С помощью шпателя, держа пробирку наклонно, отжимали влажный сыр о стенки пробирки так, чтобы жидкость могла стекать в центрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин. Прозрачную надосадочную жидкость в количестве 200 мкл отбирали и смешивали с концентрированным буфером для проведения иммунохроматографического анализа в объемном соотношении 1 : 1. Затем 140 мкл полученной смеси наносили в ИХТ. По истечении 25 мин регистрировали результаты анализа визуально и с помощью ВЦР.

Для ВЦР иммунохроматограмм использовали анализатор видеоцифровой иммунохроматографический «Рефлеком» (ООО «Синтэко-комплекс»; Россия). Измерения проводили также и с помощью рефлектометра-флуориметра «Зондаж» (ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России; Россия) (рис. 1). Экспериментальный образец ВЦР рефлектометрафлуориметра «Зондаж» позволяет регистрировать интенсивность отражения света от аналитической или контрольной зоны иммунохроматографического теста в четырех спектральных диапазонах освещения: белом 400–800 нм, красном — 650 нм, зеленом — 525 нм, синем — 470 нм. Спектральный диапазон прибора позволяет регистрировать рефлектограммы не только конъюгатов НКЗ, но и различных по окраске цветных латексных частиц субмикронного размера, часто используемых в качестве дисперсной фазы в ИХА. В режиме измерения интенсивности люминесценции прибор «Зондаж» позволяет регистрировать люминесцентные иммунохроматограммы, обеспечивает длину волны возбуждения люминесценции 380 нм и регистрации эмиссии — 490 нм. Принцип действия прибора — рефлектометрия цифровых снимков иммунохроматограмм либо регистрация интенсивности свечения люминесценции в случае люминесцентных тестов. В качестве источников света использованы излучающие светодиоды. Приемником изображения служит твердотельная видеокамера.

Прибор обеспечивает вычисление интегральной интенсивности аналитической и контрольной зон ИХТ с автоматической коррекцией базовой линии. Критерием положительного результата анализа при ВЦР с помощью рефлектометра-флуориметра «Зондаж» было превышение величины интенсивности окрашивания аналитической зоны теста над средним значением фона в «холостом» опыте с учетом ошибки измерения при 95%  доверительной вероятности:

[ Хср. – ts × SE]сигнала  ≥ [ Хср. +  ts. × SE] фона,   

где X_ср. — среднее из n измерений, t_s — коэффициент распределения Стьюдента для n измерений, SE — стандартная ошибка при 95% доверительной вероятности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тесты для выявления иммунохроматографического выявления стафилококковых энтеротоксинов были разработаны в «сэндвич»-формате с использованием МКА. Принцип действия ИХА в «сэндвич»-варианте широко описан в литературе [7–10]. Жидкая проба, потенциально содержащая антигены токсинов, вносится на подложку для нанесения образца. Под действием капиллярных сил происходит перемещение жидкости по мультимембранному композиту. Сначала солюбилизируется конъюгат НКЗ со специфическими антителами. Он окрашен в вишневый цвет, поэтому его движение по мембране можно наблюдать визуально. При этом в случае наличия определяемого антигена в пробе образуется антигенный иммунный комплекс, который с током жидкости начинает перемещаться по аналитической мембране вместе с избытком конъюгата. Далее иммунный комплекс иммобилизируется на аналитической мембране специфическими антителами в аналитической зоне (АЗ), образуя «сэндвич», а несвязанные антитела конъюгата — антителами, расположенными в контрольной зоне тест-полоски (КЗ), что приводит к образованию двух окрашенных линий. В случае отсутствия антигена в пробе антигенный иммунный комплекс не образуется, поэтому единственная видимая линия формируется за счет связывания антител конъюгата и антител КЗ (антивидовых по отношению к антителам конъюгата) только в КЗ.

Были разработаны по два варианта ИХТ для выявления SEA и SEB с использованием различных комбинаций МКА. Чувствительность ИХТ зависела от длительности иммунохроматографии, увеличиваясь по мере развития процесса в течение 25 мин (табл. 1).

Для дальнейших исследований выбрали ИХТ для выявления SEB I варианта как проявивший большую чувствительность за время анализа 25 мин.

На основании полученных данных были построены графики зависимостей показаний рефлектометрафлуориметра «Зондаж» при регистрации иммунохроматограмм SEB, растворенного в буфере анализа при освещении в различных спектральных диапазонах (рис. 2). Зависимости хорошо аппроксимируются полиномами Y = 20,49 + 12,43X – 0,041X² (освещение белым светом) и Y = 25,91 + 16,44X – 0,047 X² (освещение зеленым светом); в обоих случаях коэффициент ковариации был равен R² = 0,996. Подобные зависимости типичны для иммунохроматограмм SEB [9]. 

Как видно на графиках, отражающих корреляцию между показаниями видеоцифрового анализатора иммунохроматограмм «Рефлеком» и рефлектометрафлуориметра «Зондаж» при анализе иммунохроматограмм SEB, показания приборов коррелируют между собой линейно (рис. 3).

Показания приборов в зависимости от концентрации SEB в искусственно контаминированных молочных продуктах после проведения иммунохроматографии приведены в табл. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нормативных документах по выявлению энтеротоксинов в пищевых продуктах [4, 5] в качестве экспресс-метода рекомендован твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) с фотометрическим или люминесцентным окончанием. Упрощение проведения иммунохроматографического анализа по отношению к ТИФА достигается отказом от дополнительных обработок, промывок, инкубации с субстратами, усиливающими сигнал, а также визуальной оценкой результатов. Типичное время ИХА при применении в качестве метки НКЗ составляет 10–25 мин, чувствительность метода по белковым токсинам, как правило, лежит в диапазоне 1–100 нг/мл, в зависимости от вида токсина. Поскольку иммунохимические взаимодействия на мембране идут в неравновесном режиме, ИХА считается уступающим ТИФА по чувствительности. В то же время существуют приемы и методы, позволяющие повысить чувствительность ИХА по белковым антигенам до 0,1 нг/мл, однако это требует либо дополнительных реагентов, либо применения люминесцентных меток и приборной регистрации, что может существенно увеличить время анализа.

В наших исследованиях помимо визуальной регистрации для получения количественных данных использовалась ВЦР результатов ИХА. ВЦР иммунохроматограмм — распространенный метод получения полуколичественных и количественных результатов иммунохроматографического анализа при лабораторной диагностике заболеваний [11]. ВЦР основана на анализе цифровых снимков иммунохроматограмм специализированными программами, позволяющими определять интегральную интенсивность поглощенного света аналитической и контрольной зоны, сформированных окрашенными частицами конъюгата НКЗ со специфическими антителами. Для достижения наибольшей чувствительности регистрации должен существовать максимальный контраст между фоном мембраны и окрашенными зонами иммунохроматограмм. Учитывая, что НКЗ и его конъюгаты имеют широкие бесструктурные полосы поглощения в диапазоне 500–600 нм, контраст должен зависеть от спектрального состава освещения иммунохроматограммы. Исходя из субтрактивной теории восприятия цвета, красный объект, освещенный зеленым светом, выглядит почти черным. Так как в красном слишком мало зеленого, красный объект поглотит большую часть зеленых фотонов и почти ничего не отразит. Красный очень сильно потеряет в насыщенности и тоне и станет коричневым, серым или даже черным [12]. Освещение зеленым светом (λ_max = 525 нм) иммунохроматограмм SEB дает более интенсивный сигнал при ВЦР по сравнению с освещением  белым (рис. 2). Показания  двух различных приборов, использующих один и тот же принцип обработки сигнала, линейно кореллируют между собой, причем  отклик  ВЦР  сильнее при освещении в зеленом спектральном диапазоне (рис. 3). Те же зависимости наблюдаются при анализе искусственно контаминированных молочных продуктов после проведения подготовки проб к иммунохроматографическому анализу (табл. 2). Обобщенные данные по чувствительности выявления SEB в молочных продуктах ВЦР при освещении иммунохроматограмм в различных спектральных диапазонах приведены на диаграмме (рис. 4). Осуществление ВЦР иммунохроматограмм молочных продуктов, содержащих энтеротоксин, при освещении белым светом повышает чувствительность выявления SEB в 4 раза, а при освещении в зеленом диапазоне спектра — в 4–8 раз по сравнению с визуальной регистрацией.

Можно ожидать, что закономерности по выявлению SEB в молочной продукции будут сохраняться и при анализе SEA, учитывая схожую структуру этих белков.

Матрица, в которой находится анализируемое соединение, оказывает существенное влияние на возможность проведения иммунохроматографического анализа и чувствительность [13, 14]. Для получения подходящего результата необходимо сконцентрировать белковый энтеротоксин в гидрофильной фазе невысокой вязкости с оптимальным для проведения иммунохимического взаимодействия рН = 5,5–7,0. Такая фаза будет хорошо перемещаться по нитроцеллюлозной мембране ИХТ и обеспечит иммунохимическое связывание реагентов. Для молочных продуктов необходимо отделение сыворотки, содержащей белки, в том числе и стафилококковый энтеротоксин, от глобул молочного жира путем центрифугирования. При низком содержании жира в продукте возможен его прямой анализ без подготовки пробы. Так, результаты анализа молока 3,2% жирности с проведенной подготовкой пробы и без нее практически не отличались. Тем не менее пробоподготовка за счет разбавления образца и неполной экстракции токсина в гидрофильную фазу снижает общую чувствительность анализа.

Полученные нами результаты подтверждают возможность применения ИХТ для выявления стафилококковых энтеротоксинов в молочных продуктах, а чувствительность выявления стафилококкового энтеротоксина, достигнутая с применением ВЦР, составляет 3,8–7,5 нг/мл. Эти величины позволяют проводить анализ, удовлетворяющий нормативным требованиям к содержанию энтеротоксинов в продуктах питания не более 100 нг/г продукта.

ВЫВОДЫ

Разработаны ИХТ на основе МКА для выявления SEA и SEB с чувствительностью 10 нг/мл для каждого токсина при проведении иммунохроматографии в буферных растворах в течение 25 мин (визуальная оценка результата). ИХТ не дают перекрестных реакций при анализе энтеротоксинов типа А и В при 100-кратном превышении концентрации токсина другого типа. 3. Осуществление ВЦР иммунохроматограмм молочных продуктов, содержащих энтеротоксин, при освещении белым светом повышает чувствительность выявления SEB в 4 раза, а при освещении в зеленом диапазоне спектра — в 4–8 раз по сравнению с визуальной регистрацией.