Вирус SARS-CoV-2 - новый штамм коронавируса, выявленный в конце 2019 года во время вспышки пневмонии в Китае [1, 2, 3]. Он вызывает опасное респираторное коронавирусное заболевание человека - COVID-19. В тяжёлой форме COVID-19 осложняется пневмонией с острой дыхательной недостаточностью, которая обуславливает высокий уровень смертности.
SARS-CoV-2 является одноцепочечным РНК-вирусом, относится к роду бета-коронавирусов, генетически близок к SARS [4, 5, 6]. На сегодняшний день клиническое значение имеют бета-коронавирусы OC43, HKU1, SARS, MERS и SARS-CoV-2 и альфа-коронавирусы 229E и NL63 [2, 5, 7].
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила COVID-19 чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение (PHEIC), а затем в марте 2020 года была объявлена пандемия [6]. Уровень распространения болезни в мире расценивается как очень высокий. Число случаев заболевания, в том числе со смертельными исходами, а также число затронутых стран неуклонно растет, в связи с чем правительства разных стран принимают беспрецедентные меры для предотвращения распространения данного вируса. По данным на 30 июня 2020г. в мире зарегистрировано 10 360 882 случаев заражения коронавирусом SARS-CoV-2, 507 014 из них закончились летальным исходом. Россия по количеству случаев заражения находится на третьем месте (первое и второе – США и Бразилия соответственно), число зарегистрированных случаев на 30.06.20 – 646 929, с летальным исходом – 9 306 [8].
Для своевременного выявления заболевания и предотвращения его дальнейшего распространения на территории Российской Федерации возникла острая необходимость в создании в кратчайшие сроки диагностической системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологических образцах с высокой чувствительностью и специфичностью, что стало целью данного исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На момент начала разработки тест-системы 19.01.20 в базе данных GISAID были размещены нуклеотидные последовательности 8 полноразмерных геномов вируса SARS-CoV-2 (ранее CoV Wuhan), имеющих незначительные генетические различия: (BetaCoV/Nonthaburi/74/2020|EPI_ISL_403963-crop, BetaCoV/Nonthaburi/61/2020|EPI_ISL_ 403962, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019|EPI_ISL_ 402119, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020|EPI_ISL_402120, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019| EPI_ISL_402121, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-01/2019|EPI_ISL_402123, BetaCoV/ Wuhan/WIV04/2019 |EPI_ISL_402124, BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019|EPI_ISL_402125 и короткий фрагмент BetaCoV/Kanagawa/1/2020|EPI_ISL_402126). Для выравнивания геномов нового коронавируса SARS-CoV-2 и геномов других коронавирусов использовали программу Mega X, алгоритм Clustal W. Для выбора диагностических праймеров и зонда был определен участок генома в области гена РНК-зависимой РНК полимеразы коронавируса, RdRp, позиция 15643-15778 по последовательности MN985325. Данный участок был консервативен для всех известных на момент разработки геномов SARS-CoV-2 и имел значимые нуклеотидные отличия от последовательностей геномов других близкородственных коронавирусов, включая SARS-CoV.

Дизайн праймеров и зонда проводили в соответствии со стандартными требованиями к выбору олигонуклеотидных праймеров и TaqMan зондов [9, 10], были использованы онлайн-ресурсы Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator [11] и OligoAnalyzer Tool [12], термодинамические характеристики флуоресцентных зондов и их вторичные структуры оценивали с помощью онлайн-сервиса The mfold Web Server [13]. В качестве флуорофоров для зондов были использованы 6-Карбоксиродамин (R6G) в сочетании с гасителем флуоресценции black-hole quencher 1 (BHQ1) и Карбоксифлуоресцеин (FAM) в сочетании с гасителем флуоресценции BHQ1. Синтез праймеров и зондов проводила АО Гентерра.

Разрабатываемый набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, «АмплиТест SARS-CoV-2», предназначен для проведения всех этапов исследования: экстракции РНК вируса из образцов, обратной транскрипции и ПЦР. Учитывая особенности течения заболевания при заражении новым вирусом SARS-CoV-2, характеризующимся как поражением респираторного тракта, так и, в отдельных случаях, кишечными симптомами, в качестве материала для исследования использовали три вида клинического материала: мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки, мокроту и фекалии.
Для оценки эффективности всех стадий исследования использовали контрольные образцы. Внутренний контрольный образец (ВКО) представляет собой искусственно синтезированную рекомбинантную последовательность РНК, длиной около 500 п.о., заключенную в оболочку ms2-фага [14, 15]. ВКО добавляется на этапе экстракции РНК во все исследуемые образцы, что позволяет контролировать успешность прохождения этапов экстракции РНК, обратной транскрипции и амплификации. Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой рекомбинантную РНК, содержащую целевой участок генома коронавируса SARS-CoV-2 протяжённостью ~500 п.о., в оболочке бактериофага ms2 [14, 15]. Контрольный образец ПКО вводится на этапе экстракции нуклеиновых кислот как отдельный образец. Концентрации препаратов ВКО и ПКО измеряли методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories, США). Отсутствие остаточной ДНК в препаратах ВКО и ПКО подтверждали с помощью постановки ПЦР без стадии обратной транскрипции.

Пробоподготовку образцов клинического материала (мазков и мокроты) проводили в соответствии с опубликованными клиническими рекомендациями [16]. Подготовка образцов фекалий была несколько модифицирована, осветленный экстракт готовили, тщательно ресуспендируя 0,1 г (0,1 мл) фекалий в 0,9 мл фосфатном буфере. Центрифугировали 5 мин при 7000 g («MiniSpin», Eppendorf), отбирали верхнюю фазу.

Для экстракции нуклеиновых кислот применяли обработку гуанидинизотиоцианатом при 65°С с последующей преципитацией изопропанолом тотальной ДНК/РНК в присутствии соосадителя гликогена. После отмывки осадка от примесей и солей растворяли его в ТЕ-буфере, содержащем 0,02 мг/мл полиаденитата калия.
Обратную транскрипцию и ПЦР проводили в один этап (one step). Объём реакционной смеси составлял 50 мкл. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 25 мкл РНК-пробы, по 0,6 мМ каждого праймера (АО Гентерра, Россия), 0,3 мМ каждого зонда (АО Гентерра, Россия), 0,5 мМ каждого дНТФ (Биосан, Россия), 1 мкл TaqF полимеразы (АО Гентерра, Россия), 0,5 мкл TM-ревертазы (Mmlv) (АО Гентерра, Россия), Random-праймеры - 0,15 мМ (АО Гентерра, Россия), polyA - 0,01 мг/мл (АО Гентерра, Россия), азид натрия 0,05 % («Sigma-Aldrich», США), трис-HCl-буфер (pH 8,3) с концентрацией трис (оксиметил)-аминометана 70 мМ («Sigma-Aldrich», США), магния хлорид – не более 5 мМ («Sigma-Aldrich», США), калия хлорид – не более 80 mM («Sigma-Aldrich», США), стабилизатор ферментов – не более 0,2 мг/мл (АО Гентерра, Россия), стерильная H₂O – до 25 мкл.
ОТ-ПЦР проводили в мультиплексном формате, сигнал накопления флуоресценции ВКО регистрировали по каналу для флуорофора FAM, сигнал накопления флуоресценции при амплификации целевой НК коронавируса SARS-CoV-2 детектровали по каналу для флуорофора HEX.
Программа амплификации включала следующие стадии термоциклирования: 50°C - 30 мин; 95°C - 15 мин; следующие стадии повторялись 45 циклов - 95°C - 15 с, 60 °C - 30 с, 72°C - 15 с. Детекцию проводили при 60°C по каналам для флуорофоров FAM/HEX. Время проведения ОТ-ПЦР - около 2 часов. Результат оценивали пороговым методом, определяя Сt по пересечению кривой флуоресценции с пороговой линией, установленной на середине экспоненциального участка графика прироста флуоресценции в логарифмическом масштабе. Результаты амплификации интерпретировали как положительные, если наблюдали пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.

Аналитическую специфичность ОТ-ПЦР с выбранными праймерами и зондом оценивали в исследовании РНК штаммов коронавируса Human coronavirus 229E (ATCC® RV-740ТМ), Betacoronavirus 1 OC43 (ATCC® VR-1558™), вируса гриппа А (H1N1) (ATCC® VR-1469), вируса гриппа А (H3N2) (ATCC® VR-776) и вируса гриппа В (Victoria Lineage) (ATCC® VR-1930) из коллекции АТСС® (American Type Culture Collection, США), HCoV 229E, HCoV OC43, HCoV Nl63, SARS-CoV HKU39849, MERS-CoV (European Virus Archive Global 011N-03868 - Coronavirus RNA specificity panel), ДНК штаммов Streptococcus pneumoniae (№ 131116), Streptococcus pyogenes (№ 130001), Haemophilus influenza (№ 151221), Staphylococcus aureus (№ 201108), Klebsiella pneumoniae (№ 180129) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в концентрации не менее 1x10⁶ геномных эквивалентов в 1 мл (ГЭ/мл).

Аналитическую чувствительность (предел обнаружения) оценивали на модельных образцах биологического материала (мазки со слизистой носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий) с добавлением разведений стандартного образца - защищенной рекомбинантной РНК, содержащей целевой участок генома коронавируса SARS-CoV-2, в оболочке бактериофага ms2. Использовали следующие разведения: 1×10⁴, 5×10³, 2×10³, 1×10³, 5×10² и 1×10² ГЭ/мл. Каждое разведение тестировалось для 3 образцов каждого материала, в двух повторах. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах.

Диагностические показатели оценивали при анализе всех видов клинического материала (мазки из ротоглотки и носоглотки, мокрота, фекалии), предварительно охарактеризованного как содержащий или не содержащий коронавирус SARS-CoV-2, а также материала, полученного от здоровых людей и пациентов с иной этиологией заболевания, контаминированного стандартным образцом в концентрации не менее 10³ ГЭ/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве мишени для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 был выбран ген РНК-зависимой РНК полимеразы, RdRP, на рисунок приведено выравнивание разных последовательностей коронавируса SARS-CoV-2 и других коронавирусов на участке отжига праймеров и зонда. Нуклеотидные последовательности в данной области известных на момент разработки геномов коронавируса SARS-CoV-2 полностью идентичны и имели множество различий с геномами других близкородственных коронавирусов, что обеспечивает высокую специфичность выбранных праймеров для амплификации РНК коронавируса SARS-CoV-2 (рисунок).

Диагностический набор разрабатывался в условиях отсутствия клинического материала в Российской Федерации (не было зарегистрировано ни одного случая заболевания COVID-19), поэтому первоначально был синтезирован участок генома коронавируса в области гена RdRp протяжённостью ~500 п.о. Целевой фрагмент коронавируса был клонирован в плазмидную конструкцию, позволяющую получить рекомбинантную РНК, содержащую целевой участок генома коронавируса SARS-CoV-2, в оболочке бактериофага ms2 [14, 15]. Данная рекомбинантная РНК в белковой оболочке использовалась в качестве ПКО в составе диагностического набора, что позволяло оценить эффективность всех этапов исследования.

Оптимизация набора реагентов «АмплиТест SARS-CoV-2» произведена на зарегистрированных в Российской Федерации в качестве медицинских изделий приборах ПЦР-диагностики - Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories,США), Applied Biosystems QuantStudio 5 (Life Technologies Holdings Pte. Сингапур), ДТпрайм («ДНК Технология», Россия).

Оценка специфичности на генетическом материале других вирусов, а также бактерий, не выявила перекрёстных реакций, набор реагентов «АмплиТест SARS-CoV-2» показал 100 % аналитическую специфичность. Контроль аналитической чувствительности (предела обнаружения) набора реагентов проводили на модельных образцах биологического материала, контаминированных стандартным образцом рекомбинантого бактериофага ms2, содержащего фрагмент генома SARS-CoV-2. Для мазков со слизистой носоглотки и ротоглотки, а также мокроты предел обнаружения генома SARS-CoV-2 составил 1х10³ ГЭ/мл, для фекалий - 5х10⁴ ГЭ/мл.

Диагностическую чувствительность и специфичность оценивали на выборке из 115 модельных образцов различного биологического материала (мазки из ротоглотки и носоглотки, мокрота, фекалии), контаминированной стандартным образцом до концентрации не менее 10³ ГЭ/мл, а также на 195 пробах биологического материала, полученного от здоровых людей и пациентов с иной патологией заболевания. В дальнейшем при распространении коронавирусной инфекции в РФ клинические испытания были проведены повторно, исследовали 150 образцов мазков из носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий, содержащих вирус SARS-CoV-2, полученных от пациентов с установленной инфекцией COVID-19, а также 166 образцов биологического материала (мазков из носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий), не содержащих РНК SARS-CoV-2 (табл. 1). Диагностические показатели (чувствительность и специфичность) составили 100% (диапазон 94,2-100 % с доверительной вероятностью 95 %). Таким образом, при оценке диагностической чувствительности и специфичности на пробах от пациентов ложноположительных и ложноотрицательных случаев не было выявлено.

Известна высокая способность коронавирусов к приобретению новых мутации [17]. Мутации в областях генома SARS-CoV-2, комплементарных праймерам и зонду, могут привести к ложноотрицательным результатам или снизить чувствительность выявления клинических изолятов с нуклеотидными заменами. Для оценки накопления мутаций в областях праймеров и зонда было проведено их сравнение с последовательностями изолятов коронавируса SARS-CoV-2, опубликованными в базе данных GISAID (множественное выравнивание 50386 последовательностей c помощью алгоритма MAFFT доступно в базе GISAID на 30 июня 2020).

Результаты наличия нуклеотидных полиморфизмов в областях праймеров и зонда по данным выравнивания известных на 30.06.2020 последовательностей геномов SARS-CoV-2 приведены в таблице 2 (табл. 2).

Для прямого праймера из известных 50386 последовательностей выявлены 45 (не более 0,1% от общего количества), имеющих единичные полиморфизмы (48 нуклеотидных отличий), замены локадизуются в центральной области олигонуклеотида (в основном одна замена на праймер) и не являются критическими.

Выявлены 80 последовательностей (из 50386), имеющих по одному полиморфизму в области обратного праймера, из них 13 последовательностей имеют замену G/A на 3’ конце (замена приводит к образованию С/A эффективного неканонического взаимодействия [18]).

Выявлены также 82 последовательности с полиморфизмами в области зонда, C/T замены.

Все выявленные полиморфизмы принадлежат изолятам SARS-CoV-2, выделенных по всему миру, преимущественно в США, Австралии, Англии, Нидерландах, Швейцарии, Китае. При анализе известных 237 отечественных изолятов, расположенных в GISAID в областях прямого и обратного праймеров нуклеотидные отличия не выявлены. Один отечественный изолят (hCoV-19/Russia/StPetersburg-RII8955S/2020|EPI_ISL_450) имеет нуклеотидное отличие G/A в области зонда, однако данная замена не является критической, так как обеспечивает достаточно устойчивое неканоническое C/A взаимодействие зонда с матрицей [18], и находится близко к 3`-концу зонда.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии критических для ПЦР диагностики нуклеотидных различий в областях праймеров и зондов для всех известных изолятов SARS-CoV-2 (низкая распространённость полиморфизмов, не более одной-двух замен для одного изолята, образование устойчивых неканонических пар).

Таким образом, анализ геномов всех известных изолятов SARS-CoV-2 показал на сегодняшний день высокую надежность разработанного ПЦР набора «АмплиТест SARS-CoV-2», обеспечивающую выявление РНК коронавируса в подавляющем большинстве случаев.

Однако, необходимо отметить, что высокая изменчивость геномов коронавируса предполагает необходимость постоянного мониторинга накопления мутаций в областях праймеров и зонда у новых изолятов, с целью внесения при необходимости изменений в последовательности используемых олигонуклеотидов для сохранения высокой чувствительности диагностикума.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ФГБУ «ЦСП» ФМБА России был разработан набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом ОТ-ПЦР в реальном времени «АмплиТест SARS-CoV-2», набор содержит контроли всех этапов исследования. На момент разработки тест-системы в России не было зарегистрировано ни одного набора реагентов для выявления РНК нового коронавируса. Набор был зарегистрирован как изделие медицинского назначения 06.03.20, регистрационное удостоверение №РЗН 2020/9765, 30.06.20 внесены изменения в регистрационные документы.

В рамках проведенных технических и клинико-лабораторных испытаний, а также практике использования в клинических исследованиях, набор реагентов продемонстрировал высокие показатели аналитической и диагностической чувствительности, что делает его использование перспективным для своевременного выявления заболевания COVID-19. На сегодняшний день набор активно используется на территории Российской Федерации.